2  材料与方法

2。1  实验材料

供试材料：镇稻99和洛稻998

供试试剂：PEG、Na2HPO4。12H2O、NaH2PO4。2H2O、30％的H2O2、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、去离子水。

2。2  水稻种子萌发培养

精选饱满的两个品种水稻种子各50粒，置于垫有两层滤纸的培养皿中。加入10ml蒸馏水，置于低温10℃、适温25℃、高温40℃的培养箱中暗中萌发，共培养5d。重复三次。五天后取出培养皿，用镊子去除根芽，将留下的种子放入试管保存于液氮中。取出20颗种子去壳，低温保存，操作动作要快，避免酶失活。

2。3  实验方法

2。3。1  超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

首先我们需要配置0。05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7。8）：分别取0。2mol/L 磷酸氢二钠溶液228。75ml，0。2mol/L 磷酸二氢钠溶液21。5ml，用蒸馏水定容至1000ml，即pH7。8的0。05mol/L磷酸缓冲液。其中0。2mol/L 磷酸氢二钠溶液的配制：取71。7g的 Na2HPO4。12H2O，充分溶解，用蒸馏水定容至1000ml ；0。2mol/L 磷酸二氢钠溶液的配制：取31。2g NaH2PO4。2H2O，充分溶解，用蒸馏水定容至1000ml[10]。称取0。001g用MEDTA-Na2磷酸缓冲液定容至100ml来配制30μM EDTA-Na2 溶液。称取0。1840g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml来配制2。25mM 氮蓝四唑溶液，并且需要避光保存。称取0。0023g核黄素，用力氨酸缓冲液定容至100ml配制60μM 核黄素溶液，也需要避光保存。取2。1637Met用磷酸缓冲液（pH7。8）定容至1000ml配制14。5mM甲硫氨酸溶液。文献综述

酶液是利用0。2g去壳的种子样品，洗净后置于预冷的研钵中（研钵放在冰上，并加入1。6ml pH7。8的磷酸缓冲液研磨成浆，后转入离心管，在4℃、12000rpm下离心20min，取上清液即酶液。）

酶活性测定：分别取已经配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2 溶液0。6ml，磷酸缓冲液5。4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合后摇匀，配制成反应混合液。在试管中加入30μl 酶液和3ml 反应混合液，并标注好相应的编号以便区分。并且需要做两支对照管，其中一支加入缓冲液置于暗中，测定时用于调零用，另一支试管加30μl 磷酸缓冲液和3ml反应混合液，照光后测定作为最大光还原管。用不照光的试管为对照管调零，避光测OD560的值。酶活性计算：SOD总活性= [（Ack－AE）×V] /﹙1/2 Ack×W×Vt﹚。在方程式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；Ack 光照对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；Vt为测量时的酶液用量（ml，30ml）；W为样品鲜重（g，0。2g）[11]。

2。3。2  CAT活性的测定

采用紫外速率直接法[12]

（1）试剂配制：0。15mol/L磷酸缓冲液（PBS pH7。0）

0。2mol/L磷酸氢二钠溶液（A母液）：称取71。7g分子量为358。14的Na2HPO4。12H2O 

0。2mol/L磷酸二氢钠溶液（B母液）：称取31。2g分子量为156。01的NaH2PO4。2H2O 

0。15mol/L PBS pH7。0配制：取A母液228。75mL和B母液149。25mL混合后用蒸馏水定容至500mL。

（2）反应液配制：取200mLPBS 0。15M，pH7。0，加入0。3092mL30％的H2O2原液摇匀来配制反应液。

（3）样品测定：取3mL反应液加入0。1mL，酶液，以PBS为对照调零，测定OD240，测定30s。

（4）酶活的计算：以每分钟OD减少0。01为一个酶活单位（μ）。

CAT={△A240×Vt}/(W×Vs×0。01×t)  （μ/g min）

△A240：为反应时间内吸光度的变化

W：为样品鲜重（g）来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

t：为反应时间（s）

Vt：为提取酶液总体积（mL，1。6mL）