病原菌入侵植株并致使植物发病的过程其实质是病原菌与寄主发生相互作用的过程，Pcc在这一过程中产生了胞外水解酶、植物毒素和碳青霉烯抗生素等一系列致病因子[7~8]。胡萝卜软腐果胶杆菌的致病因子有生物膜、游动性、细胞壁降解酶（纤维素酶、蛋白酶、果胶酶）、脂多糖等。Pcc产生的碳青霉烯抗生素有利于病原菌在生存环境中竞争；蛋白酶为细菌蛋白的生物合成提供所用的氨基酸，并降解寄主产生的抗性相关蛋白；纤维素酶降解寄主的细胞壁；果胶酶是Pcc的最重要致病因子，分解并利用中间薄层和细胞壁中的果胶质，对组织进行瓦解，造成细胞质渗漏及细胞破坏，最终引起软腐病的发生。

本研究通过同源重组基因敲除技术，构建了rmsB基因的缺失突变体，并对得到的突变株进行致病相关的表型测定，通过相关生物学和致病性测定探索rsmB缺失突变体与Pcc致病性的关系。胡萝卜软腐果胶杆菌rsmB基因致病相关功能分析

1 材料与方法

1。1  材料

1。1。1  供试菌株、质粒及培养条件    胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pcc）菌株PccS1， 由本实验室分离和鉴定[6]，实验所用其它菌株和质粒见表1-1。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基， 37 ℃培养。PccS1的培养使用LB培养基，28 ℃培养。两亲结合实验使用固体TY培养基。来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

表1-1  本研究所用菌株和质粒

Table 1  Strains and plasmids used in this study

菌株或质粒Strains/Plasmids 相关特性   

Characteristics 来源 

Source

Escherichia coli

DH5α Φ80 lacZΔM15，(lacZYA-argF)U169． recA1，endA1． thi-1 Lab collection

S17-1λpir λpir pro hsdR，recA Lab collection

Pectobacterium carotovorum subsp。 carotovorum

PccS1 Wild type This lab

PccS1-R RifR, induced from PccS1 with resistance to Rif This study

Plasmid

pEX18Gm GmR, Allelic exchange suicide vector, sacB oriT(RP4) LacZ Lab collection

pEX18-P GmR, a 2338 bp fusion fraement of clpP-1、clpP-2 gene ligated in pEX18Gm This study

pBBR034 GmR , Broad-host-range cosmid vector Lab collection

pET30a expression vector,KmR Lab collection

1。1。2  培养基 

（1）LB液体和固体培养基（1000 ml）

取Tryptone 10 g、NaCl 10 g、Yeast Extract 5 g加水溶解后定容，PH调至7。0，分装后121 ℃灭菌20 min。LB固体培养在上述配方基础上加入15 g的琼脂。

（2）MMX基本培养基(1000 ml)

取5。0 g 的glucose、2。0 g (NH4)2SO4、 0。2 g MgSO4· 7H2O、 4。0 g K2HPO4、 6。0 g KH2PO4、1。0 g Na3C6H5O7·2H2O，加水溶解后定容，PH调至7。0，分装后121 ℃灭菌20 min。

（3）果胶酶检测培养基（400 ml）

取0。4 g酵母提取物、 0。4 g (NH4)2SO4、 4 ml 50%的甘油、0。4 g MgSO4、80 ml磷酸盐缓冲液（15 g Na2HPO4 + 0。7 g NaH2PO4·H2O + 1 l H2O，调pH至8。0），最后加入1。7g/100 ml的细菌琼脂粉和0。5g/100 ml的多聚半乳糖醛酸钠加水溶解后定容至400 ml，分装后121 ℃灭菌20 min。