固定化漆酶对农药毒死蜱的酶促降解(3)
1.1.2 毒死蜱的降解机制
在动植物中，毒死蜱主要通过排泄、挥发、分解、光解、氧化、脱烷基化、水解和脱氯等过程迅速代谢；在土壤中，毒死蜱主要通过相对较漫长的微生物降解。
毒死蜱在环境中代谢的主要产物为TCP，另外还可以进一步代谢为TCMP(3,5,6-三氯-2-甲氧基吡啶酚)，最终代谢为CO2[7]。Getzin等[8]和Racke等[9]用14C标记毒死蜱,在四种土壤中进行了毒死蜱降解实验,结果表明毒死蜱经土壤微生物降解,初步降解产物为吡啶酚,最终降解产物为CO2。代谢途径如图1-1所示。
图1-1 毒死蜱降解机理
Walia等[10]检测到了O,O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯一种产物。Jalal等
[11]检测到了包括TCP在内的七种产物。Singh[12]指出毒死蜱初步代谢产生DETP和TCP，两种产物在外界环境的影响下，继续代谢生成15种产物。
1.1.3 毒死蜱微生物降解的研究进展
从受农药污染严重的土壤或水体筛选、分离具有优良性状的菌种来降解残留农药是曾经采用过的一种方法[13]，并已取得一定的成就。但微生物分解受环境条件、地理因素等影响较大，赵月春等便提出可用微生物酶来降解土壤残留农药[14] 。在对微生物也能够产生的漆酶的研究过程中[15]发现，漆酶可以直接催化空气中的氧气氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A、芳香胺等，在漆酶介质（HBT、ABTS等）存在下，漆酶还能催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N-取代对苯基二胺、有机磷化合物（农药）及二噁英等[16]。由于它具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，并且该漆酶可通过有效固定化处理来延长漆酶的使用寿命，降低成本[18]，因此被作为降解毒死蜱的酶进行相关研究。
谢慧等人研究了从高效降解真菌镰孢霉属WZ-I(Fusarium LK．ex Fx)中提取的降解酶[19]，发现该酶在胞内对毒死蜱的降解率高达60.8%，细胞碎片对毒死蜱的降解率也达48%。降解酶酶促反应的最适温度为40℃和最适pH 6.8，在最适条件下10min内该降解酶对50mg/L的毒死蜱降解率高达60.8％。该胞内酶具有较好的热稳定性和pH稳定性，在实验温度范围内保温2h，仍具有较好的酶活力。但是胞外酶对毒死蜱的降解率仅为11.3%，因此难以大规模的实际应用。
微生物和酶都能有效去除环境中的农药残留。然而酶在不同温度、强酸强碱性溶剂以及有机溶剂中敏感且不稳定，在某些特定情况下它们会失去降解基质的特性，在目前的研究中，我们试图确定酶的表面固定化能够解决这些问题。
1.2 漆酶
1.2.1 漆酶的来源
漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶。早在1883年，Yoshida发现漆树分泌物中的一种蛋白质可催化漆的固化过程，1894年Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶。漆酶不仅存在于漆树的分泌物中，而且存在于多种植物、昆虫和高等真菌中。其中最主要的产漆酶者是担子菌纲中的白腐菌类[20]。
1.2.2 漆酶的结构及理化性质
1.2.2.1 漆酶的结构特征
漆酶蛋白质部分一般含有一段大约由500个氨基酸残基组成，且都有N-末端的封闭肽段。不同来源漆酶的氨基酸序列相似性并不高，这一点可以从其N-末端序列分析中得到证实。
漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用。根据磁学和光谱性质可将漆酶中的铜离子分为三类:I型Cu2+(Type 1 Cu，简称TlCu)和Ⅱ型Cu2+ (Type 2 Cu，简称T2Cu)各一个，是单电子受体，呈顺磁性，可以用核磁共振(ESR)控测；Ⅲ型Cu2+ (Type 3 Cu，简称T3Cu)两个，这对铜离子有氢氧化物为桥结合在一起，Cu2+- Cu2+共价体产生强烈的反磁性，检测不出ESR光谱信号。I型Cu2+又称蓝色Cu2+，与Cys的S配位结合形成的共价键Cu-SCys，在600nm处有强的吸收值，使酶分子呈蓝色; Ⅱ型Cu2+非蓝色，没有特征吸收峰; Ⅲ型Cu2+-Cu2+共价体，在λ330nm处有宽的吸收峰[21,22]。含四个铜原子的酶分子是最常见的形式，而某些酶蛋白的辅基有例外的情况。Palmieri G等[23]从Pleurotus ostreatus纯化了一种新型漆酶，该酶中只含有一个铜原子，却含有二个锌原子和一个铁原子，因此在600nm处没有吸收，表现为白色，而最普遍的含4铜原子的漆酶是蓝色蛋白。常见漆酶结构如图1-2所示。