Hebert等[2]于2003年正式提出了DNA条形码技术（DNA barcoding）的概念，该技术通过一段或几段长度合适的、通用DNA序列对生物界中现有物种进行快速、准确、自动化标记的识别鉴定技术。从此，DNA条形码广泛应用于植物、真菌、纤毛虫、腹足类、蜘蛛、甲壳动物、昆虫、鱼类、两栖类、鸟类以及灵长类等多个类群的生物学研究中[4]。DNA条形码技术作为传统分类学的有力补充，将鉴定过程进行标准化，避免了在分类过程中对经验的一味依赖，无论是在生物多样性、分子系统发育与进化、生物检疫，还是在食品安全、法医学、流行病学等多种领域均具有广阔的应用前景[5]。

尽管DNA条形码技术为物种快速鉴定提供了一定程度的帮助，但在实际研究中，仍存在一些局限性：其一，DNA容易发生降解，导致长片段破碎化；其二，传统测序技术只适用于少样品量的测序，而不适用于大规模物种鉴定。第二代测序技术的出现恰能克服DNA条形码技术的以上局限性。DNA条形码技术与第二代测序技术的结合推动了DNA宏条形码技术的产生和DNA宏分类学（DNA metasystematics）的发展[6]。

宏条形码技术的设计思路最初来源于环境微生物的研究[7]。根据样本来源不同可分为两类：一类是来源于环境样本，一类是来源于混合样本。通过提取环境样本（土壤、水、粪便等）或混合样本的DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，结合DNA条形码和第二代测序技术，从而实现对可操纵分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行物种鉴定的技术称为环境DNA或DNA宏条形码技术[8]，该技术解决了DNA条形码的技术障碍，摆脱了对传统形态学物种鉴定经验的过度依赖，极大提高了物种鉴定的准确性和效率。近年来，宏条形码技术在生物多样性、物种监测及食性分析等方面的应用均取得了显著进展。

本课题从分子生物学角度出发，以线粒体COI基因作为分子标记，结合DNA条形码和第二代测序技术对跳虫混合样本进行物种分类的相关研究，并利用相关生物信息学软件对数据进行处理分析，最终从分子角度上检测出了5种跳虫；对DNA宏条形码技术在跳虫中应用的可能性进行了初步探讨，并为今后土壤生物多样性、物种监测、食性分析等相关研究提供参考。

1  材料与方法

1．1  实验材料

本实验所用的样品均为实验室饲养的跳虫，利用吸虫器分别单独收集五种跳虫样本，浸泡虫体于99%浓度的酒精中并储存于-20℃冰箱中，用于后续实验。

1．2  实验仪器与试剂

1．2．1  实验仪器

显微镜：Nikon SMZ1000，Nikon SMZ800；

分光光度计；

PCR扩增仪：TC-5000；

    台式高速离心机：Centrifuge 5418；

    电泳仪：北京六一仪器厂DYY-6型；

    高压灭菌锅；

    数显恒温水浴箱：HH-2；

    电子精密天平:北京赛多利斯天平有限公司；

    耗材：枪头、离心管、PCR扩增管；（上海生工）；

    紫外分析仪：JY03型； 

1．2．2  实验试剂

    ddH2O；

    Premix Taq（TaKaRa Taq v2。0 plus dye）；

    DNA Marker；

    Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工）；

溴化乙锭（EB）；

琼脂糖；

TAE； 

1．3  实验步骤

1．3．1  DNA的单样提取

本操作中提取的模板DNA是由来自上海生工Ezup（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit）柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取，具体步骤如下：