荧光定量PCR（Real-time PCR）的扩增程序：

95℃  10min

95℃  15s

60℃  60s 40 cycles

10℃  恒温

1。5。10  蛋白分离

分离胶  H2O 1。6mL

        30%丙烯酰胺 2mL

        1。5M Tris-HCL(pH8。8) 1。3mL

        10%SDS 50µL

        10%AP  50µL

        TEMED(四乙基乙二胺)  6～8µL

    浓缩胶  H2O 1。4mL

        30%丙烯酰胺 0。33mL

        1。5M Tris-HCL(pH6。8) 0。25mL

        10%SDS 20µL

        10%AP  20µL

        TEMED(四乙基乙二胺)  6µL

    点样后，恒压80V电泳30min，再改为120V电泳知道样品跑完全程。

1。5。11  热胁迫体系 

    42℃恒温培养箱静置放置12h，后28℃恒温培养箱静置放置36h，对照组28℃恒温培养箱静置放置36h，时间结束全部收样等待测定。

1。5。12  三萜含量测定

    样品制备：精密称取烘干的样品0。03g，用95%乙醇浸泡样品并定容至10mL，超声波破壁2h，每20min摇动一次，取1mL离心（400rmp，10min），取上清800µL备用。

    样品的测定：精密吸取上清0。1mL于10mL具塞试管中，加香草醛0。2mL，高氯酸0。5mL混匀，于60℃水浴中保温20min后迅速用冰水冷却10min，再加10mL冰醋酸混匀，在550nm处测吸光值。

计算公式：W=(C×V1)/(M×V2)×100%来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

          C(µg) 从标准曲线上查得样品、分解液的三萜含量

          V1（mL）样品定容体积

          V2（mL）比色测定的所称取的试样分解液体积

          m(g)样品质量

          W(%)是三萜含量

2  结果与分析 

2。1灵芝HO基因的克隆

    通过查找NCBI数据库，获得与灵芝亲缘关系较近的污叉丝孔菌（Dichomitus squalens）中的HO蛋白和氨基酸序列，在灵芝本地数据库中查找比对其在灵芝中HO蛋白的氨基酸序列，找到其全长序列，并放置到网上进行反比，以进一步检测基因是HO氨基酸序列的正确性。设计引物将其扩增，再通过序列分析，得到灵芝中HO基因的cDNA，