2。2方法与步骤：SDS-PAGE电泳法与western blot法，高效液相色谱（HPLC）法。

2。2。1模拟体系的构建

氧化白藜芦醇、根皮素受试液的配制：首先在DMSO中进行溶解，配成50 mM母液。

大豆分离蛋白母液的配制：2 mg/mL。

ACR（1 mM）溶液配制：通风橱下精准取4。15 μL ACR溶液溶于30 mL PBS溶液。

在EP（0。2 mL容量）管中加试剂（配法见表1），做三组平行以验证实验数据真实性，然后将EP管置于37℃水浴锅中反应24小时，放-80℃备用。

表1   样品试剂添加量论文网

大豆分离蛋白control 大豆分离蛋白ACR 大豆分离蛋白ACR

OXY 

1 mM 大豆分离蛋白ACR

OXY 

2 mM 大豆分离蛋白ACR

PE

 1 mM 大豆分离蛋白ACR

PE

 2 mM

大豆分离蛋白（μL） 95 95 95 95 95 95

ACR (μL) 95PBS 95 95 95 95 95

OXY/PE

 (μL) 0 0 OXY 4 OXY 8 PE 4 PE 8

DMSO（μL） 10 10 6 2 6 2

2。2。2 SDS-PAGE电泳法

（一）样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20μl +5μl）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5～10min，取上清点样。

（二）分离胶及浓缩胶的制备

1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；

2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照说明书提示装好玻璃板；

3 按ddH2O 3mL；1mol/LTris-HCl pH=8。8 2。1mL；30% Acr-Bis 2。8mL；10% SDS 80μl；10% AP 56μl；TEMED 6μl混合均匀配制成10%分离胶8mL；

4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20min后可聚合；

5。按ddH2O 2mL;1mol/LTris-HCl pH=6。8 400μl；30% Acr-Bis 600μl；10% SDS 36μl；10% AP 24μl；TEMED 4μl混合均与配制成6%浓缩胶3。0mL；

6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；

7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20μl；

8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1h；

9 卸下胶板，剥离胶；

10。称取考马斯亮蓝R-250 1g，溶于450mL甲醇和100mL乙酸中，并加双蒸水至1L制成染色液

11。将凝胶放入染色液中，室温染色1～2h；

12。量取450mL甲醇和100mL乙酸混合，加双蒸水至1L制成脱色液；

13。将染色好的凝胶加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上，每20min更换一次脱色液（10ml冰乙酸；45mL乙醇；45mL蒸馏水）至完全脱净，最后将凝胶放入双蒸水中，以备图片扫描。

2。2。3 western blot法检测蛋白毒性文献综述