(8) 重复步骤7；

(9) 13000rpm，2min后置37℃干燥箱中静置2~3min；

(10) 将柱子放到一干净的1.5ml离心管中，加50μl 37℃预热的Elution Buffer，室温下放置2min，13000rpm，1min；

(11) 重复步骤10，将离心下来的液体倒回柱子中，加50μl 37℃预热的Elution Buffer，室温下放置2min，13000rpm，1min，收集DNA。

2.3.2.2 连接文献综述

将胶回收产物与克隆载体pEASY-T1 Simple进行连接，具体步骤参考北京全式金公司pEASY-T1 Simple Cloning Kit的使用说明书，载体与插入DNA片段的摩尔比为1:7，连接体系如下：

PCR纯化产物                  l μl

pEASY-T1 Simple克隆载体     1 μl

ddH2O                    up to 5 μl

2.3.2.3 转化

1. 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

(1) 配制Inouse转化缓冲液。

(2) 将﹣80℃保存的DH5α菌株于固体LB平板上划线，37℃培养箱中培养过夜，次日挑取单菌落接种至25ml LB培养基中，37℃，250rmp摇床培养6-8h至OD600≈1.0。

(3) 将上述培养物分别接种至三个盛有90ml LB培养液的500ml锥形瓶中，分别加入10ml、4ml和2mlDH5α菌液，于18℃摇床过夜培养，三个不同的浓度确保次日能够顺利进行下面的实验。

(4) 次日，分别测量三个锥形瓶的OD600值。当有一瓶菌液的OD600≈0.55时，将锥形瓶置冰水混合物中10min，弃掉另外两瓶。

(5) 4℃，2500rpm，10min，收集菌体。

(6) 弃上清液，加入40ml4℃预冷的Inouse转化缓冲液悬浮沉淀，4℃，2500rpm，10min，收集菌体。

(7) 弃上清液，加入6ml预冷的Inouse转化缓冲液重悬沉淀，混匀后加入DMSO至终浓度为7%，冰上放置。

(8) 分装至预冷的1.5ml无菌离心管中，每管100μl，酒精速冻后置于﹣80℃冰箱冷冻保藏。

2. 感受态细胞转化效率的测定：

(1) 从﹣80℃冰箱中取出1管DH5α感受态细胞置于冰浴中融化，然后加入1ng的PCU19，混匀后冰浴30min。

(2) 42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中放置2min。

(3) 向管中加入室温平衡好的900μl的LB培养基，37℃，180rpm摇床振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状态。

(4) 取出100μl涂布于含有Ap抗生素的琼脂平板上,正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。

(5) 次日，对平板上长出的菌落进行计数，感受态细胞的转化效率定义为1μg的质粒转入感受态细胞中所长出的菌落数。

3. 连接液转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞：

(1) 从﹣80℃冰箱中取出1管DH5α感受态细胞置于冰浴中融化，然后加入5μl连接产物,用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。

(2) 42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中放置2min。

(3) 向管中加入1mlLB液体培养基，混匀后置于37℃振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状态。

(4) 将上述菌液离心后悬浮在100μlLB液体培养基中，涂布于含有Ap、X-gal和IPTG的LB琼脂培养基平板上，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。