The name of primer                   Sequence (5'→3')                        Annealing temperature (℃)

                1492R                  GGTTACCTTGTTACGACTT                             52

          27F                    AGAGTTGATCCTGGCTCAG 

PCR 扩增体系（20 μL）：PCR-Mix：10 μL；Primer（10 μmol/L）：各 1。0 μL；DNA模板：1。0 μL；ddH2O：7。0 μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃最终延伸5 min。PCR结束后，将扩增产物用1。0 %琼脂糖凝胶进行电泳检测。

目的条带回收：采用DNA纯化回收试剂盒。用手术刀片将扩增出来的条带切割放入1。5ml EP管，后续操作按照回收试剂盒的说明书进行操作。纯化的目的条带的PCR产物送往上海桑尼生物技术有限公司进行测序，测序结果用BLAST进行相似性分析和同源性比对，通过 MEGA 4。0 软件，采用邻近法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

1。2。6“生花”细菌性微生物药敏性试验[8]

采用纸片扩散法检测“生花”细菌的药敏性。纸片扩散法即kirby-bauer(KB)试验，是将含有抗菌药的滤纸片贴在待测细菌的营养琼脂平板上，药物在琼脂内向四周扩散的过程中，其浓度呈梯度递减，故在滤纸片周围一定距离内的细菌的生长受到抑制，经18～24h培养后形成抑菌环。

本次实验采用的抗生素种类主要有9种，分别为氯霉素、红霉素、庆大霉素、青霉素、环丙沙星、四环素、万古霉素、链霉素、氨苄西林。试验时，将沾有抗生素的滤纸片放置在涂有“生花”细菌性微生物的营养琼脂平板上，以空白滤纸片为阴性对照，置于37 ℃恒温下培养16 h，观察沾有抗生素的滤纸片周围是否出现透明圈，透明圈的大小直接反映“生花”细菌性微生物对抗生素的敏感程度，无透明圈的表示“生花”细菌性微生物对抗生素不敏感，抑菌圈小于10 mm的表示低敏，在10～15 mm之间的表示中敏，大于15 mm的表示高敏。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

1。2。7“生花”微生物毒力基因检测

微生物感染致病是一个复杂的、动态的多因子作用过程，它需要众多毒力基因产物共同作用，因此通过毒力因子的检测，可以初步地判断“生花”细菌是否具有毒害作用。 

本实验采用PCR方法进行毒力基因的检测。首先，经过菌种鉴定明确“生花”细菌的类型之后，从参考相关文献找出毒力基因引物序列或者通过序列登陆号从NCBI上获得基因序列并利用引物设计软件Primer Premier 5。0进行引物设计；其次，破碎“生花”细菌的菌体以获得DNA模板，按照PCR反应体系和反应条件，进行PCR扩增。PCR 扩增体系（20 μL）：PCR-Mix：10 μL；Primer（10 μmol/L）：各 1。0 μL；DNA模板：1。0 μL；ddH2O：7。0 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃最终延伸5 min。然后，扩增产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测，以16SrDNA作为阳性对照，电泳结束后，用手术刀片将扩增出来的条带切割放入1。5 ml EP管，后续操作按照回收试剂盒的说明书进行操作；将纯化的目的DNA送往上海桑尼生物科技有限公司进行测序；最后，将测序结果进行BLAST比对，确定是否为毒力基因