2.2实验试剂
BDE-47(纯度>98%,购自Chem Service),曲克芦丁(纯度>99%,购自宝鸡方晟生物开发有限公司,ALT(购自南京建成生物工程研究所),玉米油(购自Sigma-Aldrich),Caspase-3酶活检测试剂盒(购自Calbiochem),DCFH-DA(购自Sigma-Aldrich),兔抗p-PERK (Thr980)抗体, 兔抗p-eIF2α(Ser51) 抗体,GADD34抗体 (购自Santa Cruz Biotechnology),兔抗cleaved-Caspase-3抗体 (购自Cell Signaling Technology, Inc),鼠抗Bax抗体,鼠抗Bcl-2抗体(购自BD Biosciences),鼠抗β-actin 抗体 (购自Chemicon International Inc), 20× LumiGLO® 反应液及20× Peroxide (购自cell signalling)。
2.3实验仪器
恒温金属浴(杭州大和热磁电子有限公司,型号为FeroTec HB100),冷冻台式高速离心机(德国Eppendorf公司生产,型号为5810R),紫外-可见分光光度计(日本岛津公司生产,型号UV-2501 PC ),凝胶成像系统(美国伯乐公司生产,型号Universal Hood II),水平电泳槽 (北京六一仪器厂,型号DYCP-31B),蛋白转印电泳系统(美国BIO-RAD公司),高速匀浆器(德国IKA公司,型号T10 basic),SpectraMax M2多功能酶标仪 (美国Molecular Devices公司)。
2.4 实验方法
(1)建立BDE-47诱导的小鼠肝脏损伤模型;(2)小鼠氧化应激相关指标检测:源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com获取小鼠肝脏组织及血清、制备组织匀浆液,储存在-70℃下。匀浆离心10分钟,取上清液测定活性氧ROS。(3)小鼠肝脏内质网应激指标检测:以Western blot法测定肝组织内提取的各物质并检测并进行分析。(4)小鼠肝脏细胞凋亡相关蛋白检测。
2.4.1血清制备及组织匀浆
将小鼠麻醉、处死,获取小鼠肝脏及血浆组织并称重,保存在-80°C 冰箱中冷冻1h,以3,000的转速离心5分钟获得血清。加入5倍体积(相比肝脏组织块重量)的预冷PBS液(含蛋白酶抑制剂),剪碎,再用组织捣碎机将其研磨成肝脏组织匀浆液。再以12,000g,4℃条件离心10min取上清。
2.4.2ALT的测定
ALT的活性表示为U/L,用分光光度法测定血清ALT水平,测定方法参照试剂盒说明书(建成生物技术研究所,南京,中国)。