2。2实验仪器

1。5ml离心管、鼠笼、垫料、饲料、小鼠固定器、注射器（针头为4号、总体积1ml）、放大镜台灯、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、恒温培养箱DNP-9052（上海精宏试验设备有限公司）、恒温摇床TCYQ(太仓市华美生化仪器厂）、酶标仪文献综述

3 实验方法

3。1 抑菌试验

首先将菌液保存在-80ºC冰箱中，实验时取出菌液并用LB培养基接种培（所用培养基含终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素），将平板置于37ºC培养箱中过夜培养。挑取LB平板上单菌落至含LB液体培养基的试管中（所用培养基含终浓度为100 μg/ml的氨苄青霉素）。将各试管置于摇床上于37ºC下振荡培养，每隔一段时间取出少量菌液用酶标仪测定其在波长600nm处的光密度(optical density，OD600)值，当菌液OD600值为1时取出菌液，用LB培养液稀释5,000倍，备用。化合物首先溶解在DMSO中，然后依次2倍稀释，配成系列梯度溶液，最低浓度至0。1mg/ml，配制溶液的过程中，所用的移液器吸头及塑料小管均在灭菌后使用。在无菌96-孔板的各孔中分别加入10μL各浓度化合物的溶液和90μL稀释后的菌液，混匀。另取6个孔，其中3个孔只加入菌液，另外3个孔加入1ul的氨苄青霉素（10mg/ml）和100ul菌液作为对照。然后将96-孔板置于37ºC下恒温培养18~20 h。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。上述实验重复3次，根据实验结果确定各化合物的MIC。

3。2化合物14的急性毒性研究

3。2。1小鼠的喂养

在进行尾静脉注射前先饲养三天，设定鼠房温度18-22摄氏度，控制相对湿度在50%-60%的范围内，每日用干湿球温度计估计鼠房内湿度，并做好相对湿度调节工作。保持鼠房内24小时安静状态，每日下午加满料和水，次日早上检查

并观察小鼠健康状态。

3。2。2 化合物的配制

化合物性质为疏水性、脂溶性。 我们使用DMSO、吐温-20,作为溶剂溶解化合物15。按照200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg、800mg/kg的剂量配制化合物14的溶液。     

表3-2-2  溶液组成成分

溶液（ml） 化合物（mg） DMSO（ul） 吐温-20（ul） 蒸馏水（ul） 浓度（mg/ml）

3。2。3 尾静脉注射给药

按照剂量给小鼠进行尾静脉注射，每组6只小鼠，实验组3只，均为雄性，对照组3只，均为雄性。在实验前必须禁食6小时，期间不禁水（选用没有禁食的老鼠来做试验会因为应激等因素造成反流误吸最终窒息而死）。称重并且根据剂量计算出相应重量的小鼠由尾静脉注射给药的体积。放大镜台灯连接电源并打开，将小鼠固定于固定器中仅露出尾巴，在放大镜下寻找小鼠尾巴两侧静脉，选择清晰粗大的一条进行注射，在注射前排空注射器内空气（静脉注射如果不小心进入空气形成空气栓塞会死亡的）。注射前，我们先剔除小鼠尾巴上的角质以方便我们进针，进针前让小鼠血管充盈，并用75%的酒精棉球擦拭消毒。注射时，可清晰看到白色液体从针头处向前推进（此现象表明注射成功）。注射完后我们观察到小鼠尾端血管有大量血液滞留，回流极慢，随后标记小鼠。

在开始的试验中，我们配制的溶液为混悬液，由于该化合物最终以微粒状态分散在介质中，形成非均匀体系，这对小鼠尾静脉注射造成了困难，影响了实验的准确性，因此后期实验我们纯粹使用DMSO来溶解该药品，DMSO能使化合物14完全溶解，形成溶液。我们用剩余的化合物14试配。按照尾静脉注射剂量600mg/kg配制，首先精确称取72mg化合物14于试管中，用量程为1000的移液枪加入400ulDMSO，在振荡器中震荡至完全溶解并均匀分散，此时溶液浓度为180mg/ml，随后分别给相应实验小鼠尾静脉注射。为了测定DMSO的毒性，我们分别给小鼠尾静脉注射0。05ml和0。10ml的DMSO，观察其中度症状及死亡情况。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*