1)精子数量：取20μl精子悬浮液于血球计数板上，覆以盖玻片，静置2分钟。按红细胞计数法在高倍镜(400×)计数精子总数：计数4个方格内精子数，记为A1，A2，A3，A4，然后按公式(A1+A2+A3+A4)/100×4×106=精子总数(个/ml)。1滴悬浮液中所含的精子数/滴悬浮液的体积。


2)精子活性：取一滴精子悬液涂片静置。在高倍显微镜下(×400)下观察并记录不同活动等级的精子数量，每只黑斑蛙分析100个精子。根据以下标准判断黑斑蛙精子活动能力：活力极好，速度极快进行直线运动为活动良好(a)；运动活泼但方向不定，不成直接运动为活动一般(b)；精子运动能力一般，呆滞向前摆动或原地转动，为活动不良(c)；原地静止不动或，为不活动(d)。精子活动率：η=(a+b+c)/(a+b+c+d)。 

3)精子畸形率：取部分精子悬浮液通过4层擦镜纸滤除组织碎片，滤液经 400r/min 离心5min，弃上清液，剩余少量液体与沉淀混匀，进行畸形实验，取一滴新制备的混合悬浮 液充入血球计数板内，固定在Zenker’s fluid (岑克尔氏福尔马林固定液) 中5-10min，进行HE(苏木精-伊红染色法) 染色，光学显微镜(×400)进行观察完整不重叠的精子1000个，凡出现双头或者头部无钩、香蕉状、无定形、肥胖以及双尾、尾部折叠等现象即定为畸形。 

2。2。2 电镜观察

用透视电子显微镜观察精子形态及一些细胞器的变化，将每个处理下1个精巢样品固定在2。5%戊二醛溶液中4°C过夜，然后用0。1M，pH7。0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；将固定液去除，随后对样品用磷酸缓冲液（0。1M，pH7。0）漂洗三次；将样品依次通过50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液进行脱水处理；接着用10%的乙醇处理20min；最后用纯丙酮处理20min。包埋剂梯度渗透处理：依次用体积比为1:1和3:1的包埋剂与丙酮的混合液处理样品1h和3h。梯度渗透完成后，将样品转移到干燥的新管中，再将纯包埋剂放入该管中，让样品渗透过夜。最后将渗透处理完成后的样品分别装到0。5mLeppendor管中包埋起来70°C加热过夜，待做电镜分析。

2。2。3 氧化指标ROS和MDA含量测定 论文网

ROS水平测定：取1000rpm的精巢组织匀浆上清液0。5mL以10000rpm，4℃离心15min，沉淀物即线粒体。将沉淀用预冷的0。65%生理盐水按之前的体积重悬。反应体系为19μL线粒体液，加10μLDCFH-DA（1mmol-1）混匀，置于酶标仪中37℃温浴30min（Thermo Multiskan MK3），以485nm为激发光，于538nm测荧光强度（FI）值，单位以FI·mg-1（以蛋白质计）表示。

MDA含量可用以反映机体脂质过氧化程度。用TBA法检测：MDA与TBA（硫代巴比妥酸）发生缩合反应，形成红色化合物。在532nm可见光分光光度计下测其吸光度。考马斯亮蓝法测定蛋白质。测试步骤根据试剂盒方法进行。

2。2。4 抗氧化酶活性测定

1)超氧化物歧化酶SOD测定

超氧化物歧化酶SOD用高度水溶性四唑盐WST®-1进行测定。水溶性四唑盐WST®-1与超氧阴离子反应生成水溶性的染料。在550nm下用可见光分光光度计测定吸光度，测试步骤根据试剂盒方法进行。

2)谷胱甘肽GSH测定

还原型谷胱甘肽GSH用DTNB（二硫代二硝基苯甲酸）进行测定：GSH与DTNB反应生成黄色的TNB和GSSG。TNB的产生量由GSSG和GSH的总含量决定。在405nm下测定吸光度。测试步骤根据试剂盒方法进行。

3)谷胱甘肽过氧化物酶GPx测定

谷胱甘肽过氧化物酶GPx能催化GSH反应成氧化型谷胱甘肽GSSG，消除有毒过氧化物的毒害作用。GPx的活性水平的高低可通过GSSG生成速度和GSH的消耗量来反映。GPx和二硫代二硝基苯甲酸相互作用，生成黄色的5-硫代二硝基苯甲酸阴离子。在412nm处测其吸光度。测试步骤根据试剂盒方法进行。