2。 pCambia2300/FoMV载体质粒的获得 12

pCambia2300/FoMV 质粒的抽提 13

3。 pCambia2300/FoMV及需要插入的GFP PCR1和PCR2的基因片段的酶切处理 13

4。 pCambia2300/FoMV及需要插入的GFP PCR1和PCR2的连接反应 15

5。 链接产物通过热击法转化大肠杆菌感受态细胞 15

6。 pCambia2300/FoMV-DsGFP阳性克隆的筛选及鉴定 15

7。 pCambia2300/FoMV-DsGFP阳性克隆的大量获得及纯化 17

8。 pCambia2300/FoMV-DsGFP阳性克隆的酶切验证 17

9。 pCambia2300/FoMV-DsGFP阳性克隆的测序验证 17

10。 载体质粒通过电击法转入农杆菌培养 18

11。 接种本氏烟后观察症状并收集病汁叶 18

参考文献 21

致谢 22

引言

RNA沉默是植物、动物和真菌等真核生物体内存在的一种进化上高度保守的抵抗外源病毒、核酸和转座子等的侵害，从而维持基因组完整性的防御机制，同时也是真核生物调节自身生长和发育的有效手段。

过去的20年，通过遗传、分子和生化等分析手段，已经逐步揭示并完善了RNA沉默的机制。RNA沉默根据作用阶段的不同，可以分为转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS）,和转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。转录水平的基因沉默主要是指通过染色质的重塑或者DNA的甲基化，从而抑制RNA的转录。 转录后水平的基因沉默主要是指由双链RNA或者由RDRP（RNA dependent RNA polymerases）合成的双链RNA在Dicer或者Dicer like蛋白的剪切作用下，形成20~25-nt大小的小RNA，这些小RNA和AGO蛋白形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），序列特异性的切割同源的mRNA，从而抑制基因的表达。From优T尔K论M文L网wWw.YouERw.com 加QQ75201^8766

病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS)属于转录后的基因沉默，是通过携带目的基因cDNA 片段的重组病毒载体侵染植株，随着病毒的大量复制和转录而特异性地诱导寄主植物中产生RNA沉默来抑制病毒的侵害，在这一过程中，插入的基因片段亦可以使序列同源的目的基因 mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该基因功能的鉴定。

VIGS是研究植物中基因功能的强大技术。早在上世纪20-30年代，科学家就发现了交叉保护现象，即弱毒株系与有亲缘关系的强毒株系进行杂交之后，下一代拥有抵抗病毒的能力。通过以往更进一步的研究发现，交叉保护现象其实是由于病毒诱导引起的RNA沉默，病毒的侵染使得植株产生了抗性，即病毒诱导基因沉默。在植株接种病毒的初期，病毒可以正常的繁殖，被接种的植株出现了与之相对应的感染症状。虽然新生的叶片中仅仅含有少量的从病毒中转入的基因。但是新叶子却表现出了抗病毒的特性。可以见得，VIGS可以抑制植物内源基因的表达。