VIGS技术具有许多独特的优点，可在不同遗传背景中沉默或过度表达基因。已用在多种双子叶植物物种中进行基因功能分析的功能。例如，烟草脆裂病毒衍生的载体是在双子叶植物中最广泛使用的系统之一，因为其广泛的宿主范围和感染分生组织的能力而广泛应用。目前仅有少量病毒载体可用于单子叶植物来表达异源蛋白质和沉默内源植物基因，如大麦条纹花叶病毒、雀麦草花叶病毒（BMV）、兰花花叶病毒、水稻东格鲁杆状病毒、竹花叶病毒及其相关的卫星RNA、以及黄瓜花叶病毒（CMV）。其中，BMV和CMV载体具有感染和诱导玉米中的基因沉默的能力。

狗尾草花叶病毒（Foxtail Mosaic Virus, FoMV）可以感染玉米和其他单子叶植物的能力使其成为病毒载体发展的候选者。FoMV是马铃薯X病毒属的成员，其是具有单链，正义基因组RNA的线状植物病毒。马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）为该属的代表种。基于PVX的病毒载体已经用于基因表达和病毒诱导基因沉默目的。（Baulcombe et al。，1995；Lacomme and Chapman，2008；Sha et al。, 2014）。

FoMV的全长基因组序列首次报道于1991年。存有与PVX类似的基因结构，FoMV基因组含有5个ORF：从基因组RNA表达的ORF1; ORF2，ORF3和由sgRNA1和sgRNA2表达的ORF4;和从sgRNA3表达的ORF5。两种病毒的基因组组织中的一个显着差异是FoMV具有启动CP上游143个核苷酸的独特ORF5A。5A蛋白在体内产生，但其不是复制或植物的全身感染所需的。通过用靶基因取代TGB或CP基因，将FoMV感染性克隆改造为瞬时基因表达载体，通过农杆菌介导的FoMV共转染叶组织后可以获得外源基因的高水平表达。本实验计划开发一个能通过农杆菌侵染单子叶植物寄主并通过载体插入的外源基因片段而诱导内源宿主基因沉默的FoMV的病毒载体系统。这一载体可为单子叶植物内源性基因的研究及其功能的研究提供一个有效的工具。

 第一章 基于狗尾草花叶病毒的基因沉默载体的构建论文网

引言

目前多种RNA和DNA病毒已经被修饰用作VIGS载体。将需要沉默的植物的基因片段克隆到植物病毒载体中，然后将VIGS载体通过机械接种体外转录本、农杆菌介导的转化或者通过基因枪（DNA病毒载体）转移到植物体内。在病毒侵染的过程中，诱导植物产生RNAi反应来作用病毒RNA（DNA病毒转录成的RNA），导致相应的插入的目标基因也被DCL蛋白切割成小RNA，然后在RDRP蛋白的作用下形成次级siRNA，进一步与AGO蛋白形成RISC来降解目标基因（PTGS）（Pantaleo et al。, 2007）；或者与AGO蛋白形成复合物通过对DNA或组蛋白的修饰来抑制目标DNA的转录（TGS）（Moissiard et al。, 2006）。

狗尾草花叶病毒（Foxtail Mosaic Virus, FoMV） RNA的基因组学开放阅读框架(Open Reading Frame, ORF)用框表示。第一个152-kD蛋白是RNA依赖性RNA聚合酶。假紧接着的26kD，11。3kD和5。8kD的三种蛋白质统称为三重基因嵌合体，用于介导病毒细胞与细胞的间距。5A蛋白在有机体内产生。24 kD CP位于39末端。

本实验基于狗尾草花叶病毒（Foxtail Mosaic Virus, FoMV）的基因改造，通过将狗尾草花叶病毒（Foxtail Mosaic Virus, FoMV）克隆在具有重复增强子的花椰菜花叶病毒CaMV的 35S启动子和T-DNA二元载体的胭脂碱合酶（NOS）终止子之间。构建其农杆菌侵染载体，在此基础上发展一个VIGS载体，为单双子叶植物基因功能研究提供一个有效的工具。

材料与方法

1。 实验材料

本实验中使用病毒为狗尾草花叶病毒（Foxtail Mosaic Virus）即FoMV，其病毒质粒毒源由刘玉乐教授提供 (病毒质粒基于pCAMBIA2300，卡那霉素抗性)。