富氢水对油菜幼苗耐盐性的影响及其机理研究(3)
1．2．4 生理生化数据的测定
待油菜幼苗长至四叶一心时，分别取样并测量其生理生化指标。
（1）脯氨酸（Proline）含量测定
称量约0.2 g一定质量的叶片样本于试管中，加入10 ml 3%磺基水杨酸溶液，沸水浴30分钟，冷却后过滤即为脯氨酸提取液。分别取脯氨酸提取液及不同浓度的标准脯氨酸溶液各2 ml，加入2 ml蒸馏水、2 ml冰醋酸、4 ml 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水浴30分钟，溶液呈红色，取溶液测定其在波长520 nm处的吸光度（A）值。根据吸光度绘制标准曲线并计算出样本的脯氨酸含量[20]。
（2）蛋白质（Protein）含量测定
称量约0.5 g一定质量的叶片样本于研钵中，加入5 ml磷酸缓冲液研磨成匀浆，3000 r/min离心10分钟，取上清液即为蛋白提取液。分别取蛋白提取液及不同浓度的标准牛血清白蛋白（BSA）溶液各0.3 ml，加入5 ml考马斯亮蓝试剂，摇匀放置2分钟，溶液呈蓝色，取溶液测定其在波长595 nm处的吸光度（A）值。根据吸光度绘制标准曲线并计算出样本的蛋白质含量[21]。
（3）相对含水量（RWC）测定
称量约1 g相同质量的剪碎叶片两份，一份烘干后称重，一份放入蒸馏水中吸水至饱和后称重，计算出样本的相对含水量。
（4）光合作用参数测定
使用LICOR－6400光合仪（Licor，USA）测定植物叶片的光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）。
（5）光合色素含量测定
称量约0.5 g一定质量的叶片样本于研钵中，加入10 ml 95%乙醇研磨成匀浆，过滤并用丙酮洗涤残渣至无色，将溶液定容至50 ml即为色素提取液。分别取色素提取液和空白对照溶液分别在波长665 nm、649 nm、470 nm处测定吸光度（A）值，根据吸光度计算出样本的叶绿素a（Chla）含量 、叶绿素b（Chlb）含量 、叶绿素（Chlorophy）含量、类胡萝卜素（Cx.c）含量、叶绿素a比叶绿素b比值（Chla /Chlb）[22]。
（6）抗氧化酶活性测定
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：称量约0.2g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中，加入10ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆，4000 r/min冷冻离心10分钟，取上清液即为SOD提取液。分别取SOD提取液和空白对照溶液各0.3 ml，加入5ml 50mmol/L磷酸缓冲液、0.3ml 130mmol/L蛋氨酸（Met）溶液、0.3 ml 750 µmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液、0.3 ml 20μmol/L核黄素、1 ml 100 µmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液、2 ml蒸馏水，混匀后至于4000 Lx日光下计时反应，取溶液测定其在波长560 nm处的吸光度（A）值。根据吸光度差值计算出样本的超氧化物歧化酶活性[23]。
过氧化物酶（POD）活性测定：称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中，加入10 ml预冷的磷酸缓冲液和少量10%交联聚乙烯吡咯烷酮（ppvp）研磨成匀浆，4000 r/min冷冻离心10分钟，取上清液即为POD提取液。分别取POD提取液和空白对照溶液各0.5 ml，加入1.8 ml 50 mmol磷酸缓冲液、0.6 ml 2%过氧化氢（H2O2）溶液、0.6 ml 0.5 mmol/L愈创木酚溶液，混匀后计时反应，取溶液测定其在波长470 nm处的吸光度（A）值。根据吸光度差值计算出样本的过氧化物酶活性[24]。
过氧化氢酶（CAT）活性测定：称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中，加入10ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆，4000 r/min冷冻离心10分钟，取上清液即为CAT提取液。分别取CAT提取液和空白对照溶液各0.2 ml，加入1.5 ml 50mmol/L磷酸缓冲液、1 ml蒸馏水、0.5 ml 0.1mol/L过氧化氢（H2O2）溶液，混匀后计时反应，取溶液测定其在波长240 nm处的吸光度（A）值。根据吸光度差值计算出样本的过氧化氢酶活性[25]。