1.2.4  生理生化数据的测定
待油菜幼苗长至四叶一心时,分别取样并测量其生理生化指标。
(1)脯氨酸(Proline)含量测定
     称量约0.2 g一定质量的叶片样本于试管中,加入10 ml 3%磺基水杨酸溶液,沸水浴30分钟,冷却后过滤即为脯氨酸提取液。分别取脯氨酸提取液及不同浓度的标准脯氨酸溶液各2 ml,加入2 ml蒸馏水、2 ml冰醋酸、4 ml 2.5%酸性茚三酮溶液,沸水浴30分钟,溶液呈红色,取溶液测定其在波长520 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度绘制标准曲线并计算出样本的脯氨酸含量[20]。
(2)蛋白质(Protein)含量测定
     称量约0.5 g一定质量的叶片样本于研钵中,加入5 ml磷酸缓冲液研磨成匀浆,3000 r/min离心10分钟,取上清液即为蛋白提取液。分别取蛋白提取液及不同浓度的标准牛血清白蛋白(BSA)溶液各0.3 ml,加入5 ml考马斯亮蓝试剂,摇匀放置2分钟,溶液呈蓝色,取溶液测定其在波长595 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度绘制标准曲线并计算出样本的蛋白质含量[21]。
(3)相对含水量(RWC)测定
     称量约1 g相同质量的剪碎叶片两份,一份烘干后称重,一份放入蒸馏水中吸水至饱和后称重,计算出样本的相对含水量。
(4)光合作用参数测定
     使用LICOR-6400光合仪(Licor,USA)测定植物叶片的光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)。
(5)光合色素含量测定
     称量约0.5 g一定质量的叶片样本于研钵中,加入10 ml 95%乙醇研磨成匀浆,过滤并用丙酮洗涤残渣至无色,将溶液定容至50 ml即为色素提取液。分别取色素提取液和空白对照溶液分别在波长665 nm、649 nm、470 nm处测定吸光度(A)值,根据吸光度计算出样本的叶绿素a(Chla)含量 、叶绿素b(Chlb)含量 、叶绿素(Chlorophy)含量、类胡萝卜素(Cx.c)含量、叶绿素a比叶绿素b比值(Chla /Chlb)[22]。
(6)抗氧化酶活性测定
     超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:称量约0.2g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入10ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆,4000 r/min冷冻离心10分钟,取上清液即为SOD提取液。分别取SOD提取液和空白对照溶液各0.3 ml,加入5ml 50mmol/L磷酸缓冲液、0.3ml 130mmol/L蛋氨酸(Met)溶液、0.3 ml 750 µmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液、0.3 ml 20μmol/L核黄素、1 ml 100 µmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液、2 ml蒸馏水,混匀后至于4000 Lx日光下计时反应,取溶液测定其在波长560 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度差值计算出样本的超氧化物歧化酶活性[23]。
     过氧化物酶(POD)活性测定:称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入10 ml预冷的磷酸缓冲液和少量10%交联聚乙烯吡咯烷酮(ppvp)研磨成匀浆,4000 r/min冷冻离心10分钟,取上清液即为POD提取液。分别取POD提取液和空白对照溶液各0.5 ml,加入1.8 ml 50 mmol磷酸缓冲液、0.6 ml 2%过氧化氢(H2O2)溶液、0.6 ml 0.5 mmol/L愈创木酚溶液,混匀后计时反应,取溶液测定其在波长470 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度差值计算出样本的过氧化物酶活性[24]。
     过氧化氢酶(CAT)活性测定:称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入10ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆,4000 r/min冷冻离心10分钟,取上清液即为CAT提取液。分别取CAT提取液和空白对照溶液各0.2 ml,加入1.5 ml 50mmol/L磷酸缓冲液、1 ml蒸馏水、0.5 ml 0.1mol/L过氧化氢(H2O2)溶液,混匀后计时反应,取溶液测定其在波长240 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度差值计算出样本的过氧化氢酶活性[25]。
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