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富氢水对油菜幼苗耐盐性的影响及其机理研究(4)
抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定:称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入10 ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆,4000 r/min冷冻离心10分钟,取上清液即为APX提取液。分别取APX提取液和空白对照溶液各0.2ml,加入1 ml 50 mmol/L磷酸缓冲液、1ml 100 µmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液、0.1 ml 5 mmol/L抗坏血酸(ASA)溶液、0.1 ml 20 mmol/L过氧化氢(H2O2)溶液,混匀后计时反应,取溶液测定其在波长290 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度差值计算出样本的抗坏血酸过氧化物酶活性[26]。
谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定:称量约0.2 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入10 ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆,4000 r/min冷冻离心10分钟,取上清液即为GR提取液。分别取GR提取液和空白对照溶液各0.2ml,加入1 ml 50 mmol/L磷酸缓冲液、1 ml 100 µmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液、0.1 ml 10 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液、0.1 ml 2.4 mmol/L NADPH溶液,混匀后计时反应,取溶液测定其在波长340 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度差值计算出样本的过谷胱甘肽还原酶活性[27]。
(7)过氧化氢(H2O2)含量测定
称量约0.5 g一定质量的叶片样本于预冷的研钵中,加入5 ml预冷的10%三氯乙酸溶液研磨成匀浆,12000 r/min冷冻离心15分钟,取上清液即为过氧化氢提取液。分别取过氧化氢提取液及不同浓度的标准过氧化氢溶液各0.5 ml,加入0.5 ml 0.1mol/L磷酸钾缓冲液、1 ml 1mol/L碘化钾(KI)溶液,混匀后置于黑暗条件下反应1小时,取溶液测定其在波长390 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度绘制标准曲线并计算出样本的过氧化氢含量[28]。
(8)丙二醛(MDA)含量测定
称量约0.2 g一定质量的叶片样本于研钵中,加入10 ml 10%三氯乙酸溶液研磨成匀浆,4000 r/min离心10分钟,取上清液即为丙二醛提取液。分别取丙二醛提取液和空白对照溶液各5 ml,加入5 ml 0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,沸水浴30分钟,冷却后4000 r/min离心10分钟,取上清液测定其分别在波长450 nm、532 nm、600 nm处的吸光度(A)值。根据吸光度计算出样本的丙二醛含量[29]。
(9)相对电导率(Relative conductivity)测定
使用电导仪测定植物叶片的相对电导率。
(10)Na+、K+离子含量的测定
用20 mM EDTA-Na2浸泡植株30 min,去离子水冲洗干净。将植株分为叶、秆和根三部分烘干,分别称取干样 0.2 g放入洗净烘干的消煮管中,加入HNO3–HClO4(V:V=87:13)混合液5 mL,12 h后置于电热消煮仪(Milestone Ethos T, Italy)上进行消煮。待消煮完成后,用2.5% HNO3定容至10ml,用ICP( Perkin Elmer Optima 2100DV)测定溶液中Na+、K+离子含量。
1.3 数据处理
使用Microsoft Office Excel 2010进行数据整理和计算,使用IBM SPSS Statistics 20进行显著性差异分析,使用GraphPad Prism 6、Origin 8.1进行图表制作
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