基于磁珠分离技术的氯噻啉上转换荧光免疫分析方法的研究(3)
1.2 方法
1.2.1 上转换纳米材料（UCNPs）合成
准确称取0.2823 g Y2O3，0.1182 g Yb2O3和0.0115 g Er2O3于150mL平底烧瓶中，加入适量浓硝酸，加热至溶液完全澄清，将多余的浓硝酸蒸干，制得Ln(NO3)3。加入5.5 mL去离子水于上述蒸干的Ln(NO3)3中，超声15 min，然后在快速搅拌条件下加入1.7 mL 0.6 mol/L的柠檬酸钠溶液，形成Ln3+-柠檬酸钠溶液。最后在快速搅拌下，缓慢加入25 mL 1.0 mol/L的NaF溶液，溶液逐渐变浑浊，有白色沉淀出现，滴加完毕后用NaOH溶液将上述混合液的pH值调至5，快速搅拌1 h。搅拌完毕后将其转移至不锈钢高压反应釜中，在180℃条件下反应6 h。反应结束后，自然冷却至室温，去上层液体，下层纳米颗粒分别用超纯水和无水乙醇各洗涤三次，60℃烘干，备用。
1.2.2 上转换纳米材料（UCNPs）氨基功能化
基于经典的Stöber法对UCNPs表面进行氨基功能化修饰。称取40 mg上转换纳米材料于120 mL异丙醇中，超声15 min，快速搅拌30 min。将其转移至35℃恒温箱中，在搅拌条件下加入5 mL的氨水和40 mL的水，然后逐滴加入40 mL含有50 μL正硅酸四乙酯的异丙醇溶液，反应5 h。最后再逐滴加入60 mL含有400 μL（3-氨丙基）-3-乙氧基硅烷的异丙醇溶液，反应1 h。反应结束后，将反应产物离心分离，分别用超纯水和无水乙醇各洗涤两次，60℃条件下烘干，4℃条件下贮存备用。
1.2.3 氨基功能化Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）合成
基于溶剂热法制备氨基功能化制备氨基功能化Fe3O4磁性纳米材料[8]。准确称取6.5 g 1,6-己二胺、2.0 g 无水醋酸钠和1.0 g FeCl3•6H2O。将其加入到30 mL乙二醇中，在50℃加热条件下搅拌至形成均质胶体溶液。将上述胶体溶液转移至100 mL不锈钢高压反应釜中，在196℃条件下反应6 h。反应结束后，自然冷却至室温。使用外界磁场将黑色的纳米材料（即MNPs）分离出来，MNPs分别用超纯水和无水乙醇各洗涤3次。最后获取的氨基功能化Fe3O4 MNPs在60℃下烘干，4℃条件下贮存备用。
1.2.4 纳米材料与氯噻啉人工抗体、抗原偶联
采用经典戊二醇交联法制备氯噻啉抗体标记的UCNPs [9]。准确称取10 mg氨基功能化的UCNPs，加入到5 mL PBS（pH=7.4）中，超声波水浴30 min使纳米材料完全分散在PBS中。然后，加入100 mg硼氢化钠和1.25 mL 25%浓度的戊二醇，缓慢振荡，室温下反应1 h。离心获取UCNPs并用PBS淋洗3次。随后，将收集的UNCPs分散至5 mL PBS中，加入0.6 mL1 mg/mL氯噻啉抗体。室温下，缓慢振荡6 h。振荡完成后，离心去除多余的抗体。加入5 mL 1% BSA试剂（0.01 M PBS, pH=7.4）继续振荡6 h去除非特异性结合及未反应的氯噻啉抗体标记的UCNPs。最后，将收集获得的氯噻啉抗体标记的UCNPs分散至5 mL 0.01 mol/LPBS中，4℃下贮存。用相同的方法将氯噻啉抗原与氨基功能化的MNPs（磁性纳米材料）偶联获得氯噻啉抗原标记的MNPs。
1.2.5 基于UCNPs和MNPs免疫分析方法的建立
基于UCNPs和MNPs建立了上转换荧光免疫分析，是一种竞争性免疫分析方法。取280 μL氯噻啉标准品和80 μL氯噻啉抗原标记的MNPs于1.5 mL离心管中，涡旋混匀。然后，加入200 μL氯噻啉抗体UCNPs共轭体（2 mg/mL）。37℃下温育60 min后，使用外界磁场将MNPs分离出来，用PBS洗涤3次。将收集的MNPs转移至0.5 mLPBS中，使用F-2700荧光分光光度计检测荧光强度。
1.2.6 免疫分析工作条件优化
包括纳米材料的用量、pH值、钠离子浓度、甲醇含量和温育时间在内的实验参数对免疫分析结果有重要影响甲醇含量和温育时间在内的实验参数对该免疫分析方法的灵敏度影响很大，需要对其进行条件优化。