外源钙对梨石细胞形成及不同形态POD的影响研究(2)
外源钙对梨石细胞形成及不同形态POD的影响研究
梨是世界上重要的落叶果树。在我国，梨是一种大面积种植的果树，梨果品产量稳居于世界第一。梨树在我国栽培的历史悠久，是我国第三大果树，产量和面积均居世界首位[1]，因为其多汁清甜的独特风深受人民喜爱。随着经济的快速发展，人们对果品口感的要求也在不断提高，而梨石细胞对其加工工艺以及鲜果品质的影响非常关键[2]。生产中常常用叶面喷施氯化钙的方法降低石细胞含量。梨石细胞是一种强烈木质化的细胞，POD则被认为是植物木质化过程中的一种起重要作用的酶。
‘砀山酥梨’是我国的畅销梨品种，有果实饱满、色泽明亮、皮薄汁多的优点[3]，同时也有石细胞含量过多，石细胞团较大的缺点[4]。本研究选择‘砀山酥梨’作为试验材料，通过叶面喷施不同浓度氯化钙，并以清水为对照，对石细胞含量、木质素含量、细胞质过氧化物酶活性、细胞壁结合过氧化物酶活性进行测定，以期针对梨品质下降的现实问题，提出有关梨种植方法的相关建议。
1 材料与方法
1．1 材料
以江苏省高邮市果树实验场的‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri cv.‘Dangshansuli’)为实验材料，分别于盛花后开始，每隔十天，共四次对其进行0.25%、0.5%、0.75%氯化钙(CaC12)叶面喷施，以喷清水的作为空白对照，并于花后每隔七天取有代表性的果实样品进行分析，果实发育前期间隔天数较短，果实发育后期间隔天数较长，可做适当调整，并带回实验室保存于4℃冷柜备用。
1．2 方法
1．2．1 冷冻法测石细胞含量 取果肉，切成1.0cm3正方形，在-16~20℃冰柜中保存24h，解冻后，用离心机22000 r/min离心1、3、5min[5]。将离心好的果肉匀浆置入容量为1000mL的烧杯中，并加水到800mL。然后用玻璃棒搅拌充分且静置3min左右，倒出上层悬浮液。不断漂洗，直至液体清澈透明。将烧杯底部的石细胞用称量过的粗滤纸过滤。后将滤纸上的石细胞与滤纸一同放入烘箱，在60~65℃的温度下烘2h，取出，冷却直至室温，而后称量，减去滤纸的重量，精确到1mg。
1．2．2 Klason法测木质素含量 梨木质素含量测定采用Klason法。取烘干的梨果肉，研磨成均匀粉末，过筛（200目）。后用甲醇抽提，烘干，取0.2g干粉，在30℃下用15mL72%H2SO4抽提1h，加入115mL蒸馏水煮沸1h，保持总体积不变。过滤反应后的混合液，并用500mL热水冲洗，同时测量酸碱度，直至冲洗液呈中性，得到的木质素烘干后称重。
1．2．3 石蜡切片观察石细胞团 将果肉组织用FAA固定液（甲醛：冰醋酸：50%酒精=5mL：5mL：90mL）固定24小时后，进行乙醇脱水处理，而后再用二甲苯、乙醇按照不同比例对材料进行透明处理。石蜡包埋成1cm3四面平滑、材料正中的小块，用摇转式切片机切片并展片、贴片。制片完成再次用二甲苯和乙醇进行脱蜡、脱水处理。脱水步骤完成之后，采用番红固绿染色法进行染色，最后将切片放在显微镜下拍照观察[6]。
1．2．4 GPOD活性测定 以愈创木酚（Guaiacol）作为底物进行连续测定的过氧化物酶测定方法。反应体系包含磷酸钠缓冲液（10mM，pH6.4）、0.125%过氧化氢、0.2%愈创木酚及100μL酶提取液。于470nm波长下连续测定反应液吸光值3min，测量时以每分钟吸光值变化0.01为一个活性单位（U）。
1．2．5 SPOD活性测定 以丁香醛连氮（SYR）作为底物进行连续测定的过氧化物酶测定方法。参照Lee和Lin（1996）[7]的方法进行。3mL反应体系中包含0.1mL酶提取液，磷酸缓冲液（50mM，pH6.0），1.5mM过氧化氢和0.04%丁香醛连氮（SYR）。测定470nm波长下吸光值的变化。另以提取缓冲液代替过氧化氢作为空白对照，以每分钟吸光值变化0.01为一个活性单位（U）。