猪卵母细胞IVM和精子质量对胚胎发育影响的研究(2)
猪卵母细胞体外成熟培养后的质量取决于三方面：卵母细胞成熟培养前的质量、成熟培养的条件、成熟后用于受精的卵母细胞质量。在实际操作中，一般将胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)分为两类，包被3层以上卵丘细胞的定义为优级卵，3层以下1层以上的定义为次级卵。将两类卵母细胞分别进行成熟培养时，优级卵的成熟率高于次级卵，且差异极显著；将成熟的卵母细胞进行体外受精后，优级卵的囊胚率、囊胚总细胞数均高于次级卵，且差异极显著[3]。IVM（卵母细胞体外成熟培养）时，温度、湿度、气相环境、培养液成分都对卵母细胞的成熟有影响。通常进行的IVF显示胞质的内含物特别是折光体(refractile bodies)与低受精率相关[4]。De Sutter等[5]报道“理想的卵母细胞”（即无内含物或颗粒状胞质的卵母细胞占收集到的全部卵母细胞的34%），对于完全成熟的胞质而言，其外观变化并不影响受精率与胚胎质量。研究表明[6]，根据第一极体的形态学特征对MII期的卵母细胞进行分级，能反映卵母细胞级别与受精率的关系，受精率与PB1形态显著相关(P <0.025)，1、2级卵母细胞的受精率明显高于3、4级。
猪精液过滤离心洗涤后的精子质量，即精子活力、精子畸形率和顶体完整率对精子体外受精能力和胚胎的发育也有影响。有研究表明，精子的活力并不是体外受精能力的决定性因素，相比较而言，精子的顶体完整率对体外受精能力的影响更为重要[7]。Suzuki等[8]在研究猪的精子预培养时间对其穿透体外卵母细胞能力的影响时，发现用猪鲜精进行体外受精，精子的活力与受精率无关。前向运动精子总数、精子顶体反应阳性率和精子正常形态百分率,是能体现精子质量和功能的参数，顾斌等[9]在探讨优化处理后精子这三项参数与IVF受精率和囊胚率之间的关系时，发现精子经过处理后，前向运动精子总数<5×106时，IVF受精率显著低于其他组；当前向运动精子总数≥5×106时，顶体反应阳性率和精子形态对IVF受精率和优胚率没有明显影响。
本研究在大量关于卵母细胞IVM和精子质量对体外受精及胚胎发育影响的研究基础上，通过对照试验来探讨猪的卵母细胞体外成熟前卵母细胞的选择、猪精子获能前的活率及不同的获能效果对猪体外受精和胚胎发育的影响。为优化猪的体外受精，提高体外胚胎生产能力提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器设备 恒温水浴锅（HH-4，国华电器有限公司）；二氧化碳培养箱（Thermo，美国）；体式显微镜（Nikon，日本）；荧光显微镜（Olympus，日本）；超净工作台（6FA63666型，上海智诚分析仪器制造有限公司）；恒温热台（国产定制，北京）；可调式移液枪（Thermo，美国）；电子天平（Sartorius，德国）；高速离心机（DDL-5，韩国）。
1.1.2 卵母细胞、精液及相关试剂 卵巢购自江苏淮安苏食肉品有限公司下属的屠宰场；三元猪鲜精液购自江苏南京附近的猪场；新淮猪鲜精液来自江苏省淮安市新淮猪保种场；生理盐水、硫酸庆大霉素、青霉素、链霉素等购自南京天元大药房；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；Etomoxir（乙莫克舍）、M-199培养基、矿物油、BSA（牛血清蛋白）、EAA（必需氨基酸）、NEAA（非必需氨基酸）、CB（松胞菌素B）、CHX（放线菌酮）、透明质酸酶、链酶蛋白酶等以及其他无机盐类购自Sigma公司；L-GlutaMAX、PBS购自Gibco公司；PMSG、hCG购自宁波第二激素厂。
1．2 溶液的配制
1.2.1 获能液A NaCl：113mmol/L，KCl：3mmol/L，GaCl2•2H2O：7.5mmol/L，Glucose：11mmol/L，Sodium Pyruvate：5mmol/L，Caffeine：10.3mmol/L。