猪卵母细胞IVM和精子质量对胚胎发育影响的研究(3)
1.2.2 获能液B NaCl：113.1mmol/L，KCl：3mmol/L，GaCl2•2H2O：7.5mmol/L，Glucose：11mmol/L，Sodium Pyruvate：5mmol/L，Caffeine：2mmol/L，Tris：20mmol/L，BSA：0.2%。
1.3 方法
1.3.1 卵母细胞的采集和体外成熟 卵巢运回实验室后，放入37℃恒温生理盐水（含适量青霉素和链霉素）中，用带18G针头的10ml注射器吸取3-6mm卵泡中的卵泡液，放入50ml离心管。等采集的卵泡液沉淀10分钟后，将上层液吸出，加入适量ASP，混匀后，用滴管吸取适量于显微镜下，挑选出胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体，用ASP洗两遍后，放入加了卵母细胞体外成熟培养液并覆油的四孔培养板（每孔400ul）。在恒温38.5℃，相对湿度100%，CO2浓度5%的培养箱中培养42小时。
1.3.2 成熟卵母细胞的处理 用100ul移液枪吸取成熟的卵母细胞，放入0.1%的透明质酸酶中，轻轻吹打，直至颗粒细胞与卵母细胞分离。在显微镜下用T2将成熟的卵母细胞洗1遍，用PZM-3洗2遍，在洗液中卵母细胞要一个个分散开（先用移液枪，再用口吸管）。此过程剔除死的卵子，挑出活的卵母细胞，于体外受精前转移到在5% CO2，100%湿度的CO2 培养箱中预先平衡过的体外受精四孔培养板（每孔体外受精液为400μl，石蜡油覆盖）内。
1.3.3 鲜精的处理和质量检测 在烧杯上放双层纱布，对原精液进行过滤，用稀释液A进行1:1稀释。从过滤稀释后的猪精液中用去尖头的1000ul移液枪头取出适量精液，用稀释液A稀释50倍，采用血细胞计数板计数法计算经处理的鲜精精子密度。用去尖头枪头取200ul处理后的鲜精液，加入200ul伊红染色液，静置1min后，加入100ul苯胺黑染色液，混匀后，吸取2ul于载玻片，用盖玻片进行抹片，晾干后在显微镜下数精子死活，得出精子死活率。用去尖头枪头取适量精液，用稀释液A稀释10倍，取5ul于载玻片，盖上盖玻片，在显微镜下数精子畸形个数，得出精子畸形率。
1.3.4 体外受精和胚胎培养 用去尖头枪头从处理后的鲜精液取出1ml，再按1:1加入洗精液DPBS（含0.1% BSA），1500rap/min，离心3min。弃1.6ml上清液，在离心后的精液沉淀中加入1ml获能液稀释，然后用去尖头枪头吸取获能液稀释的精液装于小皿，在38.5℃，5%CO2，100%湿度条件下的CO2培养箱中悬浮获能40min。用去尖头枪头将获能后的精液转移到卵母细胞所在的体外受精培养液，使受精液内精子密度为7.5×105ml-1。受精盘在38.5℃，5% CO2，100%湿度的CO2培养箱培养6h。将所有受精卵吸出，用PZM-3液洗掉卵周围的精子，转移到胚胎培养液中，在38.5℃，5% CO2，100%湿度的CO2培养箱中培养。观察卵裂率、桑葚胚率和囊胚率。
1.3.5 观察多精入卵 吸取一部分胚胎培养10-14h的受精卵到Pro液滴 ，消化透明带，将卵用口吸管吸出放入T2液中静置5-10min，用T2洗两次，放入DPBS洗一次后，用甲醛洗一次，转移至甲醛液滴进行固定，静置25-30min。用DPBS洗掉卵上的甲醛后，将卵放入赫斯特染液（避光）液滴，避光静置12-15min。取出染核后的卵，在DPBS中洗掉染液，制成压片。在显微操作仪上用蓝色荧光观察多精入卵的情况。
1.4 统计与分析
试验的每个处理重复三次，检测数据用`X±S表示，然后用SPASS（Version 17.0）进行单因素方差分析。