1。4。2预培养

取大小约为1cm2的烟草幼叶，用刀片轻轻地划伤主脉和四周的叶肉，近轴面朝下，接种于诱导培养培养基（MS+ 1。0mg/L BA +0。1 mg/L NAA），黑暗条件下预培养2天。

1。4。3侵染

取出预培养后的无菌苗叶片，浸入制备好的农杆菌侵染液中，静置或轻微摇晃15min，尽量使每块叶片都能与农杆菌菌液充分接触。

1。4。4共培养

取出侵染过的外植体，用无菌滤纸吸干叶片表面附着的多余菌液，将叶片近轴面朝下接种于共培养培养基（MS+1。0mg/L BA +0。1 mg/L NAA），黑暗条件下共培养2-3天。

1。4。5筛选培养

共培养2-3天后，当叶片边缘与培养基接触处出现些许肉眼可见的淡淡菌迹时，取出叶片，用含500mg/L头孢霉素（Cef）的无菌水冲洗3-5次，每次3-5min，以洗去外植体表面的农杆菌，然后用无菌滤纸吸干叶片表面附着的多余液体。接着将叶片转接入含有Hyg和Cef的筛选培养基上进行前两轮的筛选培养。大概20天左右更换一次培养基，直到长出不定芽。