大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(5)
①准备工作。
1）检查Buffer P1中是否已经加入RNase A。
2）检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。
3）检查Buffer P2和P3是否出现沉淀。
②在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养过夜。
③取2 ml过夜培养的菌液，8000 g 离心2 min收集菌体，弃尽培养基。
④在菌体沉淀中加入250 ul Buffer P1，吸打或震荡至彻底悬浮菌体。
⑤加入250 ul Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4 min。
⑥加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀。
⑦于离心机最大12000 g离心5-10 min，将上清全部小心移入吸附柱，9000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
⑧向吸附柱中加入500 ul Wash Solution，9000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
⑨重复步骤8一次。
⑩将空吸附柱和收集管放入离心机，9000 g离心1 min。在吸附膜中央加入50-100 ul Elution Buffer，室温静置1-2 min，9000 g离心1 min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
2.2.1.2 质粒DNA的电泳鉴定
（1）实验原理
DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开[18]。
（2）实验方法
①称取0.24 g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入30 ml TAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开（30 sec）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。
②戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60°C）。取1ul EB加入三角瓶中，摇匀。
③把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。
④在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至110 V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。
⑤待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。
⑥在凝胶上选择加样孔。用10 ml的吸液头分别将样品加入凝胶的加样孔中。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。
⑦打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30 min。
⑧当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1 cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。
⑨将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照。
⑩清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。
2.2.1.3 质粒DNA的酶切验证
（1）实验原理
Ⅱ型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
（2）实验方法
①混合下列溶液于一个无菌的1.5 ml微量离心管中：
10×H Buffer 2.0 ul
EcoR Ⅰ 0.5 ul
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