除草剂乳氟禾草灵降解菌株S10的分离鉴定及其降解特性研究(2)
微生物来降解乳氟禾草灵是目前该类除草剂被降解的主要方式，且在有氧条件下可以使其降解速率加快[6]。乳氟禾草灵在土壤中被降解，其主要降解产物为脱乙基乳氟禾草灵和三氟羧草醚[7]。其中降解产物三氟羧草醚，在土壤中容易移动，其移动性与土壤性质和有机质含量有关[7]。
目前如除草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵等多种二苯醚类除草剂的降解菌株已经被分离筛选出来[8]。Hiratsuka等发现Coriolus versicolor可降解除草醚和氯代除草醚[9]。Keum等发现 Sphingomonas wittichii RW1可降解除草醚、甲氧除草醚和乙氧氟草醚[3]。Chakraborty 等发现Azotobacter chroococcum可降解乙氧氟草醚，且可以利用其作为唯一的碳氮源 [10]。Smith-Greenier等筛选得到的6株非发酵革兰氏阴性杆菌，它们能够降解禾草灵[11]。Liang 等分离出了Brevundimonas sp. LY-2可以降解乳氟禾草灵[8,12]。Qiu等分离出了Brevundimonas sp. LY-1可以降解乙羧氟草醚[13]。
由于乳氟禾草灵在内的二苯醚类除草剂用量逐渐增加且应用范围扩大，逐渐出现残留药害的问题，限制了农业产区合理的作物轮作，对农业生产等造成了一定的损失，影响了农业、种植业等结构的调整[14,15]。
乳氟禾草灵在土壤、水体等环境中的残留动态过程与微生物的降解与转化密切相关，了解微生物在这一过程中的作用，对于该除草剂残留的去除具有一定的理论和实践意义。本文开展了乳氟禾草灵降解菌的分离工作，并对降解菌株在不同条件下的降解特性进行了研究，为乳氟禾草灵的生物降解与污染土壤的生物修复提供菌株资源。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试土壤
来自长期生产乳氟禾草灵的农药工厂的污泥，多点取样，装入封口袋保存。
1．1．2 试剂
乳氟禾草灵原药原药（98%）用甲醇溶解配制成10,000 mg/L的储存液以备用。凝胶回收试剂盒，Taq DNA聚合酶、T4连接酶和pMD19-T 载体，氨苄青霉素（Amp）。甲醇（高效液相色谱分析）为色谱纯试剂。二氯甲烷等其它化学试剂均为普通的分析纯试剂。
1．1．3 培养基
无机盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 1.0 g/L，pH 7.0。固体培养基加入15 g/L琼脂粉。
LB培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0。固体培养基加入15 g/L琼脂粉。
TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。
1．1．4 仪器
控温培养箱、可控温摇床、PHS-3C型pH计（上海精科雷磁），琼脂糖凝胶电泳仪，PCR仪，岛津UV-2401PC紫外-可见光连续扫描仪（SHIMADZU），5415R小型高速离心机（Eppendorf），BH-2型显微镜（O9LYMPUS），高效液相色谱仪（Waters 600）。
1．2 降解菌株的分离、筛选及纯化
称取10~15 g土样置于装有100 mL含50 mg/L乳氟禾草灵的无机盐液体培养基中，30 ℃、160 r/min摇床振荡培养，培养6 d后，以10 % 的接种量转接到相同的含50 mg/L乳氟禾草灵的无机盐培养基中，连续富集，转接4次。
富集液经过紫外扫描以及高效液相色谱分析测定了有降解效果后，取100 µL富集液进行梯度稀释，取合适的浓度梯度的样品100 µL，在含100 mg/L乳氟禾草灵的无机盐固体培养基的平板上涂布，于30 ℃恒温培养，5 d后，选取有透明圈周围无其他菌落的单菌落，并用接种环在含药的平板上划线纯化，纯化后得到单菌，将单菌接入LB液体培养基中培养[13]，然后再接种于含50 mg/L乳氟禾草灵的无机盐液体培养基中，于30 ℃、160 r/min摇床培养5 d [8]。并检验单菌的降解效果。