1.3  乳氟禾草灵的检测方法
1.3.1  紫外扫描法   
在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷,剧烈振荡5 min后,静置分层,吸取下层的有机相,加入足量的无水硫酸钠从而去除体系中残余的水分,对有机相使用用紫外-可见分光光度计在200~350 nm的波长范围内进行扫描,根据乳氟禾草灵特征吸收峰的变化情况来判断菌株的降解能力。
1.3.2  高效液相色谱(HPLC)   
待测样品用HCl将pH调至3.0,使用等体积的二氯甲烷提取,充分振荡,静置分层,吸取下层有机相,并取2.0 mL有机相置于2 mL离心管中,置于通风橱中挥发。挥发完全后加入0.4 mL甲醇(色谱纯)溶解(辅助漩涡震荡仪震荡5 s),经孔径0.22 m的有机相滤器过滤后,用Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪,测定样品中乳氟禾草灵的浓度。
高效液相色谱条件:色谱柱,Phecda C18(4.6 mm×250 mm);流动相,甲醇∶水(80:20 v/v);流速,1 mL/min;检测双波长通道:230 nm,250 nm;进样量,20 µL。
1.4  降解菌株的形态特征、生理生化分析
降解菌株形态特征以及各种生理生化鉴定的方法依据《常见细菌系统鉴定手册》[16] 进行。
1.5  降解菌株的16S rDNA基因序列的测定
1.5.1  菌株基因组总DNA的提取   
使用SDS高盐沉淀法来完成菌体总DNA的提取[17]。在获得单菌的LB平板上挑取单菌落,于含有3 mL LB液体培养基的试管中接种,30 ℃、160 r/min摇床培养过夜;6,000 r/min 转速下离心5 min,收集菌体,使用相等体积的TE缓冲液洗涤菌体,再进行一次6,000 r/min 转速下离心5 min,使用相等体积的TE缓冲液悬浮菌体;再加入20 μL 浓度为100 mg/mL的溶菌酶,37 ℃水浴1 h后,加入10 μL 浓度为20 mg/mL的蛋白酶K,颠倒数次使体系充分混合后,再加入200 μL 10%的SDS,37 ℃水浴过夜;加入为体系1/3体积的饱和NaCl溶液,充分剧烈振荡,12,000 r/min离心5 min,收集上清液,并用等体积酚∶氯仿抽提,12,000 r/min离心5 min,直至分界面无蛋白;收集上清液,用0.6倍体积的异丙醇沉淀,12,000 r/min离心10 min,使用浓度为70%的乙醇溶液洗涤沉淀,待乙醇完全挥发后将沉淀溶于100 μL的TE缓冲液中[8,18]。
1.5.2  降解菌16S rDNA的PCR扩增   
细菌的16S rDNA片段是一个较为保守的区域,通过对菌株16S rDNA的序列测定和比较分析[19],可进一步鉴定出菌株的分类地位。
使用扩增细菌的16S rDNA通用引物,扩增出菌株的16S rDNA的片段。扩增细菌16S rDNA的通用引物为27F(上游引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(下游引物:5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) [20,21]。
50 μL PCR扩增体系:10×Taq Buffer 5.0 μL,dNTP(25 mmol/L)2.5 L ,Mg2+(25 mmol/L)4.0 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.5 L, ddH2O 36.0 μL,上、下游引物(25 μmol/L)各1.0 L。
聚合酶链式反应(PCR)条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,循环32次;72 ℃延伸10 min[22]。
1.5.3  切胶回收   
采用PCR回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收 16S rDNA的基因片段,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小约为1.5 kb。
1.5.4  酶连   
将回收片段连接到pMD 19-T载体上。10 L片段体系:10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL,载体(PMD 19-T)2.0 L,回收的片段6.0 L,T4 DNA Ligase 0.6 L,ddH2O 0.4 L。为保证片段与载体连接上,片段体系与载体的体积比值约为3:1。4 ℃,过夜。
1.5.5  普通感受态细胞的制备和转化   
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