除草剂乳氟禾草灵降解菌株S10的分离鉴定及其降解特性研究(3)
1．3 乳氟禾草灵的检测方法
1．3．1 紫外扫描法
在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡5 min后，静置分层，吸取下层的有机相，加入足量的无水硫酸钠从而去除体系中残余的水分，对有机相使用用紫外-可见分光光度计在200~350 nm的波长范围内进行扫描，根据乳氟禾草灵特征吸收峰的变化情况来判断菌株的降解能力。
1．3．2 高效液相色谱（HPLC）
待测样品用HCl将pH调至3.0，使用等体积的二氯甲烷提取，充分振荡，静置分层，吸取下层有机相，并取2.0 mL有机相置于2 mL离心管中，置于通风橱中挥发。挥发完全后加入0.4 mL甲醇（色谱纯）溶解（辅助漩涡震荡仪震荡5 s），经孔径0.22 m的有机相滤器过滤后，用Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪，测定样品中乳氟禾草灵的浓度。
高效液相色谱条件：色谱柱，Phecda C18（4.6 mm×250 mm）；流动相，甲醇∶水（80:20 v/v）；流速，1 mL/min；检测双波长通道：230 nm，250 nm；进样量，20 µL。
1．4 降解菌株的形态特征、生理生化分析
降解菌株形态特征以及各种生理生化鉴定的方法依据《常见细菌系统鉴定手册》[16] 进行。
1．5 降解菌株的16S rDNA基因序列的测定
1．5．1 菌株基因组总DNA的提取
使用SDS高盐沉淀法来完成菌体总DNA的提取[17]。在获得单菌的LB平板上挑取单菌落，于含有3 mL LB液体培养基的试管中接种，30 ℃、160 r/min摇床培养过夜；6,000 r/min 转速下离心5 min，收集菌体，使用相等体积的TE缓冲液洗涤菌体，再进行一次6,000 r/min 转速下离心5 min，使用相等体积的TE缓冲液悬浮菌体；再加入20 μL 浓度为100 mg/mL的溶菌酶，37 ℃水浴1 h后，加入10 μL 浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，颠倒数次使体系充分混合后，再加入200 μL 10%的SDS，37 ℃水浴过夜；加入为体系1/3体积的饱和NaCl溶液，充分剧烈振荡，12,000 r/min离心5 min，收集上清液，并用等体积酚∶氯仿抽提，12,000 r/min离心5 min，直至分界面无蛋白；收集上清液，用0.6倍体积的异丙醇沉淀，12,000 r/min离心10 min，使用浓度为70%的乙醇溶液洗涤沉淀，待乙醇完全挥发后将沉淀溶于100 μL的TE缓冲液中[8,18]。
1．5．2 降解菌16S rDNA的PCR扩增
细菌的16S rDNA片段是一个较为保守的区域，通过对菌株16S rDNA的序列测定和比较分析[19]，可进一步鉴定出菌株的分类地位。
使用扩增细菌的16S rDNA通用引物，扩增出菌株的16S rDNA的片段。扩增细菌16S rDNA的通用引物为27F（上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（下游引物：5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） [20,21]。
50 μL PCR扩增体系：10×Taq Buffer 5.0 μL，dNTP（25 mmol/L）2.5 L ，Mg2+（25 mmol/L）4.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 L， ddH2O 36.0 μL，上、下游引物（25 μmol/L）各1.0 L。
聚合酶链式反应（PCR）条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循环32次；72 ℃延伸10 min[22]。
1．5．3 切胶回收
采用PCR回收试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）回收 16S rDNA的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小约为1.5 kb。
1．5．4 酶连
将回收片段连接到pMD 19-T载体上。10 L片段体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，载体（PMD 19-T）2.0 L，回收的片段6.0 L，T4 DNA Ligase 0.6 L，ddH2O 0.4 L。为保证片段与载体连接上，片段体系与载体的体积比值约为3:1。4 ℃，过夜。
1．5．5 普通感受态细胞的制备和转化