葡萄Rs基因的克隆序列分析及时空表达特征鉴定(3)
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
‘巨峰’葡萄（Vitis vinifera cv Kyoho）果实采自江苏农博园葡萄种植基地。果实大小如图1所示。
图1 植物材料
Fig 1 Plant material
1．1．2 菌株和载体
大肠杆菌菌株（E coli）为DH5α；农杆菌菌株为EHA105；载体为pCAMBIA1302。以上菌株和载体均由本实验室保存。
1．1．3 酶及生化试剂
Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、PCR试剂盒购于TaKaRa宝生物工程有限公司；PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于捷倍思生物基因技术有限公司；B5、琼脂、蔗糖、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠均购于索莱宝（Solarbio）科技有限公司。
1．1．4 引物与测序
引物合成及DNA测序均由上海生工（Sangon）完成。
1．1．5 培养基
（1）B5固体培养基：B5 3 21g/L；琼脂8 5g/L；蔗糖30g/L；6-BA 0 6mg/L；NAA 6mg/L。
（2）LB固体培养基：15g琼脂；5g酵母提取物；10g胰蛋内胨；10gNaCl，用NaOH调节pH值为7 0，用蒸馏水定容至1L，121℃、高压灭菌。
（3）LB液体培养基：5g酵母提取物；10g胰蛋内胨；10gNaCl，用NaOH调节pH值为7 0，用蒸馏水定容至1L，121℃、高压灭菌。
1．1．6 主要仪器与设备
恒温水浴锅、高速离心机、超净工作台、PCR仪、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统DNA数据检测仪、恒温摇床、恒温培养箱、微量分光光度计、高压蒸汽灭菌锅。
1．1．7 生物信息学分析
通过National Center for Biotechnology Information即NCBI获得葡萄Rs基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。
1．2 方法
1．2．1 葡萄基因组总RNA的提取及cDNA合成
采用改进后的CTAB法提取巨峰葡萄果肉和果皮总RNA，具体操作步骤如下。于预冷的研钵中加入适量葡萄果肉或果皮，同时加入液氮快速充分研磨成粉末。将粉末转入2ml离心管，每管加入1ml的A试剂（由0 1M Tris、0 3M山梨醇和10%PEG配制而成）和2%β-ME，4℃、8000rpm离心5min，弃上清，加入1ml的B试剂（由0 1M Tris、2% CTAB、1 4M NaCl和20mM EDTA配制而成，并用H3BO3调节PH至5 4）和2%β-ME，55℃水浴20min，其中每10min上下晃动一次，后预冷，加入100μl的C试剂（5M KAC）、100μl的C2H2OH和600μl氯仿，涡旋，后4℃、10000rpm离心10min，取上清900μl于新的2ml离心管中，并加入等体积氯仿，涡旋，后4℃、10000rpm离心10min。取上清600μl于1 5ml离心管中，加入1/3VLiCl、0 8V异丙醇和1%β-ME，于-20℃冰箱中静置2-4h后洗沉淀并点样、电泳检测RNA质量，同时取1μl用微量分光光度计测其浓度与纯度。按照TaKaRa Prime ScriptTM RT-PCR Kit操作说明进行cDNA第一链的合成。
1．2．2 目的基因的分子克隆
根据GenBank中已报道的葡萄白藜芦醇合酶基因序列（登录号：NC_012022 3）设计PCR扩增引物：上游引物rs1：5’-TTTAGAAACGCTCAACGTGCC-3’；下游引物rs2：5’- GCACAACAGTTTCGATGGTCA-3’。根据载体pCAMBIA1302，选取两个酶切位点，加酶切后上游引物rs3：5’- GAAGATCTTTTAGAAACGCTCAACGTGCC-3’；下游引物：rs4：5’-CTAGCTAGCGCACAACAGTTTCGATGGTCA-3’引物由擎科生物有限公司合成。使用25 0µl的PCR反应体系：l0xPCR缓冲液2 5µl，提取的样品cDNA 2 0µl，上游引物rs1（25mM）1 0µl，下游引物rs2（25mM）1 0µl，dNTPs（10 mM）0 5µl，rTaq DNA聚合酶0 2µl，灭菌的无核酸重蒸水17 8µl，离心混匀。在PCR仪中94℃预变性5min后，按以下程序进行PCR扩增：94℃变性30s；53-64℃的温度梯度退火30s；72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸l0min结束反应。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。按照胶回收试剂盒说明回收DNA，以回收产物为模板利用引物rs3、rs4跑PCR，并回收目的片段。