葡萄Rs基因的克隆序列分析及时空表达特征鉴定(4)
1．2．3 基因的生物信息学分析
（1）美国生物技术信息中心NCBI：http://www ncbi nlm nih gov/
（2）开放框阅读分析：https://www ncbi nlm nih gov/orffinder/
（3）Motif分析：http://bioinformatics psb ugent be/webtools/plantcare/html/
（4）BLASTP检索：https://blast ncbi nlm nih gov/Blast cgi
（5）蛋白结构域分析：http://www ncbi nlm nih gov/Structure/cdd/cdd shtml
（6）氨基酸理化性质分析：http://web expasy org/protparam/
（7）二级结构预测：https://npsa-prabi ibcp fr/cgi-bin/npsa_automat pl?page=npsa_sopma html
1．2．4 基因表达特异性分析
采用qRT-PCR技术、用试剂盒以及iQTM5 Software和iQTM5 Real-time PCR System分析不同发育阶段葡萄果皮和果肉中目的基因的表达特性。根据克隆获得的目的基因序列设计引物，上游引物序列为：5’-ACTTGAAGCAACAAGGCACG-3’ ；下游引物序列为：5’-TGGTGGCTTTTTCCCCCTTT-3’，以葡萄的actin基因为内参基因，上游引物序列为：5’-TACAATTCCATCATGAAGTGTGATG-3’ ；下游引物序列为：5’-TTAGAAGCACTTCCTGTGAACAATG-3’。扩增体系总体积为20 0µl，其中cDNA模板1 0µl、上、下游引物各0 4µl、2*supermix 10 0µl、双蒸水8 2µl。扩增程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s、55℃退火15s，共40个循环；72℃保温10s。绘制熔解曲线，并根据 计算基因的相对表达量，其中， = - [10]。
1．2．5 葡萄皮愈伤组织的诱导与培养
将带柄的葡萄果实流水冲洗2-6小时，在超净工作台内先用无菌水冲洗一遍，再用70%酒精摇洗30s后用无菌水冲洗一遍，随后0 1% HgCl2消毒8分钟，最后无菌水冲洗3-5遍。将灭菌消毒后的葡萄去掉果肉，将果皮切成1 5-2 5cm的小片，接种于B5培养基中，25士1℃条件下暗培养。
继代时选择上部疏松、长势良好的愈伤组织转接到继代培养基中，每瓶转接材料3至4块，均匀放置于培养基表面。25士1℃条件下暗培养。每28d继代一次。
1．2．6 细菌转化方法
T连接反应：取0 2ml离心管，加入目的片段4 5µl、pMD19-TVector0 5µl、Solution I 5 0µl，混合均匀于16℃连接6h。连接完成后转化大肠杆菌。
大肠杆菌转化和提取：
（1）将连接产物离心后于冰上吸5 0µl加入慢慢融化后的33 0 ul DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，立即冰上30min。
（2）将管置于42℃水浴热激90s，立即冰上2min。
（3）加入800µl无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃摇床震荡1h（不需要出现浑浊的现象）。8000rmp离心5min。
（4）去700µl上清液，留100µl菌液吸打均匀，涂布于100mg/L Amp（母液100mg/ml,待固体培养基温热，加入Amp的母液）的LB固体培养基上，37℃、过夜培养，观察菌落生长情况。
（5）将过夜培养后，平板长出的单菌落挑取12个，转入含有100mg/L Amp的LB液体培养基中（或者吸出1000ul的LB液体培养基，加入1ul的Amp母液），150rpm振荡培养，直至出现浑浊。取1 0-2 0ul菌液进行PCR鉴定，并取400µl送上海生工（Sangon）测序。确定PCR和测序结果没有问题后用试剂盒提取质粒，电泳检测质粒，以确定质粒大小及浓度。
对目的基因和载体分别进行双酶切，电泳检测并回收目的片段。
构建表达载体连接反应：载体大片段1 0μl、目的片段7 0μl、T4Buffer 1 0μl、T4连接酶1 0μl，Total 10 0μl。混匀，16℃过夜。
表达载体转化反应：与T连接反应相近，即转化大肠杆菌（感受态DH5ɑ）。
重组质粒PCR鉴定：提取转化后的菌落质粒，PCR法鉴定阳性克隆。1%琼脂糖凝胶电泳检测。并测序。
重组质粒的酶切鉴定：提取转化后的菌落质粒，用限制性酶进行双酶切。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小是否正确。