萝卜花青素合成关键基因的分离克隆与表达分析(2)
图3 萝卜花青素合成相关基因（ABGs）的结构及可能的功能区域9
图4 培养10天和30天时各基因的RT-qPCR结果112
图5 培养10天和30天时各基因的RT-qPCR结果2 13
图6 培养50天时各基因的RT-qPCR结果1 14
图7培养50天时各基因的RT-qPCR结果2 15
图8 基因表达与花青素含量关系的热成像图 16
表1基因克隆的引物6
表2 PCR扩增体系 6
表3 RT-qPCR引物7
表4 萝卜中花青素生物合成相关基因（ABGs）的序列信息9表5 萝卜中可能存在的花青素生物合成相关基因的特征 10
萝卜花青素合成关键基因的分离克隆与表达分析
引言
萝卜(Raphanus sativus L.)是十字花科、萝卜属一、二年生草本植物。其原产于中国，适应性强，营养价值高，现已成为全球广泛栽培的具有重要经济价值的蔬菜。萝卜的肉质根是其主要食用部位，肉质根的颜色有很多种，如：绿皮红肉、绿皮白肉、白皮白肉、红皮红肉、红皮白肉红心等，这主要与萝卜中积累了大量的花青素有关。
花青素（Anthocyanin）是一类广泛存在于植物体内的水溶性天然色素，属于类黄酮化合物。现已知的花青素有20种[1]，其中在植物中常见的有6种，即天竺葵色素(Pelargonidin)、矢车菊色素(Cyanidin)、飞燕草色素(Delphindin)、芍药色素(Peonidin)、牵牛花色素(Petunidin)和锦葵色素(Malvidin)。存在于萝卜中的花青素主要是矢车菊色素(Cyanidin)和天竺葵色素(Pelargonidin)[2]。花青素有助于植物授粉和种子传播。已有研究表明，天然花青素对提高植物抗胁迫能力有重要作用。除此之外，花青素还有重要的营养和保健功能，有助于预防心脑血管疾病、护肝、抗癌等。
花青素生物合成途径是植物类黄酮途径的一个分支，苯丙氨酸是花青素和其它类黄酮物质生物合成的直接前体，花青素是在细胞质中由苯丙氨酸经一系列的酶促反应合成的。由苯丙氨酸到花青素的合成路径被划分为三个阶段。第一个阶段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA，这一过程在苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）、4-香豆酰CoA连接酶（4CL）基因调控下完成，是许多植物次生代谢共有的路径[1]。第二阶段由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇，这一过程在查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）催化下完成；第三阶段，二氢黄酮醇在类黄酮-3'-羟化酶（F3'H）和类黄酮3',5'-羟化酶（F3'5'H）催化下生成双氢槲皮素和二氢杨梅黄酮，它们在二羟黄酮醇-4-还原酶（DFR）的催化下生成无色花青素，经花色素合成酶(ANS)合成有色的花色素[3]。经过这三个阶段，花青素的基本碳骨架形成，之后还要对其进行糖基化和甲基化修饰。修饰过程由花色苷3－葡糖基转移酶（3GT）、花色苷5－葡糖基转移酶（5GT）和甲基转移酶（MT）催化。花青素经过糖基化和甲基化修饰后，转运到液泡中进行储存。目前，有关花青素运输与液泡聚集方面的机理尚不十分清楚，已有研究表明，谷胱甘肽S－转移酶（GST）及多药和有毒化合物排出家族（MATE）与花青素的转移有关。
目前，对于植物中花青素生物合成的分子机制的研究主要集中于单个组织或器官中，而且多集中于成熟阶段[4][5][2]。越来越多的研究表明，随着植株的生长，花青素在植株体内的分布不是均一的，而是相对集中地分布于特定的组织和器官中[6][7]。对甜樱桃[8] 、石斛[9]、桑葚[10]、葡萄[11]、甘薯[12]等植物的研究表明，不同植物组织中花青素的合成不是连续的，说明调控花青素生物合成的基因（anthocyanin biosynthetic genes，即ABGs) 在植物体内表达时会受到时空调控[11][13]。Salvatierra等人在对草莓的研究中发现，草莓中ABGs的转录水平在草莓果实成熟阶段大大提高，而且在红色组织中这些基因的表达水平远远高于白色组织中[14]。在紫薯植株发育初期，其叶子和茎秆中ABGs的表达水平较高，并在发育的中后期达到顶峰[12]。在萝卜中，不同发育阶段不同组织中花青素的积累水平也有差异，但这一现象潜在的分子机制尚不清楚。