萝卜花青素合成关键基因的分离克隆与表达分析(3)
本研究在前人工作的基础上，以‘Nau-YH’、‘Nau-XLM’、‘Nau-XBC’、‘Nau-YZH’ 四个萝卜品种为试验材料，测定各萝卜品种不同组织不同发育阶段花青素含量，并对花青素合成相关的基因进行分离克隆和序列表达分析，以硏究萝卜中花青素的生物合成与基因表达的关系。通过本研究，期望对萝卜花青素性状的遗传改良提供技术参考和理论依据。
1 材料与方法
1．1 植物材料
本实验采用四个萝卜品种：‘Nau-YH’、‘Nau-XLM’、 ‘Nau-XBC’、‘Nau-YZH’（其肉质根颜色分别为：红皮白肉、绿皮粉肉、白皮白肉、红皮红肉）作为实验材料。将挑选的萝卜种子进行表面消毒，置于潮湿的滤纸上暗培养3天。待其长出幼苗后，再转移到盛有腐殖土和泥炭（1:1）的营养钵中，并转入温室中进行培养。在温室中培养的光周期为：14h光照/10h黑暗，培养温度为：18℃。
1．2 萝卜花青素单体含量的测定
本实验采用盐酸-乙醇提取法测定萝卜组织中的花青素含量。分别取培养了10天（皮层分裂前期）、30天（皮层分裂期）、50天（直根膨大期）的萝卜肉质根作为样本。在每次实验之前，先将萝卜肉质根的果皮和果肉分离开，并切成小块。进行三次重复操作得到三组样本，将一组样本储存在-80℃冰箱中供之后全基因组RNA的提取，其余两组新鲜的样本则用来进行花青素的测定。花青素测定方法参考Mehrtens（2005）的方法略作修改。在提取花青素之前，先将萝卜组织置于液氮中充分研磨，取2g研磨后的植物组织加6mL盐酸-乙醇提取液（盐酸：80%乙醇＝1:99，V/V），将混合物置于摇床中于110rpm的速度下室温避光培养24h，之后用0.4M醋酸钠溶液（PH4.5）和0.025M盐酸溶液（PH1.0）组成的缓冲溶液将1mL萝卜成熟提取物（或2mL萝卜幼苗提取物）稀释至10mL。再用紫外分光光度计分别测定提取液在530nm和657nm处的吸光度值。花青素含量的计算公式为：Q=（A530-0.25×A657）/FW,其中，Q为花青素相对含量，FW为样品鲜重，单位为g，Q单位为1。所有样品均进行3次测量。数据的分析和图表的绘制将使用Jmp-sas统计软件和Microsoft Office Excel2010版完成。