菊花CmHsfB1基因的克隆及其功能鉴定(2)
3．1 CmHsfB1序列特征及功能特性研究 9
3．2 CmHsfB1影响植物中ROS水平 9
致谢 10
参考文献 10
菊花CmHsfB1基因的克隆及其功能鉴定
菊花（Chrysanthemum morifolium）原产中国，居我国十大名花第三位，也是世界四大切花（菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲）之一，具有很高的观赏与经济价值。在菊花的生产过程中，蚜虫等植食性昆虫对菊花的取食则会消耗植株营养，诱发煤污病，影响光合作用，并传播病毒病，导致菊花产量和品质受到严重影响，从而造成经济损失。挖掘优异抗逆基因，并进行相关基因功能研究，是菊花抗性基因工程育种的前提。所以，培育具有优良抗性性状的菊花新品种是菊花现代育种的重要目标。
转录因子Hsf家族是植物中数量最多的转录因子家族之一，参与植物响应不良环境的多种过程。大量研究表明，Hsf参与植物响应多种非生物胁迫（盐、干旱、高温、低温等）和生物胁迫（昆虫的取食、病原菌侵染）。植物Hsfs基因最早从番茄中克隆得到[1]。Hsf转录因子的庞大性使其功能呈现多样性，参与植物的各种生命活动，然而在菊花中，尚无关于Hsf研究的报道。开展菊花相关Hsf的克隆和功能鉴定对于菊花抗逆性分子机制解析及抗性分子育种具有重要意义。
蚜虫、线虫等病虫害对植物生长有着严重的威胁[2]，目前，对Hsfs家族在植物受病虫害时的表达仅有少数研究。研究表明，AfHsfA1b超表达拟南芥株系比野生株系抗病性更强[3]，而hsfB2b缺失突变拟南芥株系的抗病性要强于野生株系[4]。可知A类Hsfs家族成员对植物的抗病性有正调节作用，B类Hsfs家族成员对植物抗病性可能有负调节作用。截至目前，尚未有对Hsfs家族参与植物抗蚜性的研究报道。
为此，本研究从菊花中克隆得到CmHsfB1，对其进行序列分析、氨基酸同源性比对和系统进化树分析，并对其进行表达特性分析，明确了菊花CmHsfB1转录因子的基本特征；另外，利用农杆菌介导的叶盘法开展遗传转化，以得到CmHsfB1超表达菊花，对获得的超表达株系进行蚜虫接种鉴定，通过分析超表达CmHsfB1转基因植株的表型、生理变化及ROS水平，初步明确了CmHsfB1参与菊花抗蚜性的功能及调控机理。
1 材料与方法
1．1 材料
菊花品种‘神马’来自南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。本研究所用化学试剂均由Sigma公司提供。植物表达载体pMDC43和农杆菌菌株EHA105等均由菊花遗传育种与分子生物学实验室保存。各种工具酶类由Takara公司和Invitrogen公司提供。
1．2 CmHsfB1基因克隆、序列分析及系统进化树构建
根据菊花表达谱进行序列拼接后，选取注释为Hsf相关基因的序列片段，设计最大开放阅读框（openreadingframe，ORF）引物。本实验引物由Prime5软件设计。
1．2．1 菊花‘神马’基因克隆 首先提取RNA，步骤如下：称量0.05-0.1 g样品，迅速转移至预冷过的研钵中，用研杵研磨植物组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；向研钵中加入1mL RNAisoReagent，使之完全覆盖研磨成粉末状的样品，室温静置，至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状；将研磨匀浆转移入2mL离心管中，室温静置5min，放入离心机，4℃，12000 rpm离心5min；小心吸取上清液，移入1.5mL离心管中；加入1/5体积氯仿，盖紧离心管盖，用力振荡，待溶液变至乳白状，室温静置5min，放入离心机，4℃12000 rpm离心15 min；重复3-4次上述两步，直至水相及有机相间无明显蛋白残留；吸取上清液转移至另一新的1.5 mL离心管中；向上清液加入等体积的异丙醇，振荡混匀后，-20℃放置30 min；9.4℃，12000 rpm，离心l0 min，试管底部会出现白色絮状沉淀；小心弃去上清，加入lmL75%冷乙醇，轻轻上下颠倒将沉淀悬起；4℃，12000 rpm，离心5 min，小心弃去乙醇，尽量除净；在通风橱内干燥沉淀15min，加入适量的RNase-free水溶解；将完全溶解的RNA 保存至-80℃超低温冰箱。