菊花CmHsfB1基因的克隆及其功能鉴定(3)
后进行反转录操作，步骤如下所述。配制下列反应液于微量离心管中：
Total RNA 20-50 μg
10×DNase I Buffer 5 µl
Recombinant DNase I （RNase-free） 2 μl （10 units）
RNase Inhibitor 20 units
DEPC-treated water up to 50 μl
Total 50 µl
37℃反应20-30分钟；加入0.5 M EDTA溶液2.5 μl，混匀，于80℃加热处理，2min后再用DEPC treated water定容至100 μl，使 Recombinant DNase I失活；加入3 M醋酸钠10 μl、及冷乙醇250 μl，混匀后放置于-80℃20 min；4℃，12,000 rpm离心10 min，弃上清；再加入70%冷乙醇洗净，设置4℃，12,000 rpm离心5 min，弃上清；干燥沉淀；用适量的DEPC treated water溶解后，进行Agarose电泳操作，以确认是否除去基因组DNA，同时测定RNA的浓度；在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
Total RNA 1 μg
Oligo（dT）18（0.5 μg/μl） 1 µl
DEPC-treated water up to 11 μl
Total 11 µl
混匀后于70℃保温10 min，迅速置于冰上2 min后；加入以下反应液：
5 × M-MLV Buffer 4 μl
RNase Inhibitor （40U/μl） 0.5 µl
dNTPs Mixture （10 mM） 2 μl
RTase M-MLV （RNase H-）（200 U/μl） 1 μl
DEPC-treated water 1.5 μl
Total 9 µl
总反应体积20 μl，42℃ 1 h，70℃ 15 min；取出置于-20℃保存。
反转录后通过PCR扩增进行全长验证，琼脂糖凝胶电泳得到目的片段，后进行切胶纯化回收，回收产物进行连接并转化大肠杆菌DH5α。