水稻黄叶突变体的生理分析与基因定位(2)
本次实验所用材料为水稻黄化叶色突变体yl1，将其与野生型水稻日本晴同时进行培养，并在其苗期的不同时期对其表型进行观察对比，并测定叶绿素含量以及与叶绿素合成相关元素的含量。在其抽穗期观察对比野生型和突变体的表型及测定旗叶中叶绿素含量，待其成熟后测量其株高、结实率等农艺性状。利用网站上已公布的水稻基因选取一些Indel标记，通过PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测将黄叶突变基因确定于一个大致的区间上，完成对目标基因的初步定位。通过以上实验可以基本了解黄叶突变体yl1的表型及生理特征，并可对其突变基因进行初步定位。
1 材料与方法
1．1 材料
水稻品种日本晴野生型；
从60Co-γ辐射诱变的日本晴突变体库中筛选到的水稻黄叶突变体yl1；
黄叶突变体yl1与窄叶青8号的杂交F2群体。
1．2 黄叶突变体表型及生理特性测定
1．2．1 材料培养及苗期表型观察
将水稻日本晴野生型与黄叶突变体yl1的种子在45℃烘箱内保存一周打破休眠，清水中浸泡3天，然后在32℃培养箱避光催芽24小时。选取萌发一致的种子播种在96孔板上，自来水培养1周后换营养液(参照国际水稻研究所配方)培养。分别在培养至7天、11天、14天时对日本晴野生型与突变体yl1的表型进行观察记录。
1．2．2 测定叶绿素、类胡萝卜素及与叶绿素合成相关的元素含量
1．2．2．1水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量的测定
分别在第7天、11天、14天取日本晴野生型与突变体yl1植株的第2片叶，称取约0.2g，切成2-3cm长的组织块，设置4组重复，浸入80%（v/v）丙酮，黑暗室温条件下放置至叶片完全漂白，分别在646.6nm、663.6nm和470nm波长下测量叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸光度[4]，根据波拉等人[5]的公式确定叶绿素a和叶绿素b含量。
类胡萝卜素浓度：Cx. c (mg/L) = (1000A470 －3. 27Ca －104Cb ) /229[6]
色素含量(mg/g) = 色素浓度(mg/L) ×提取液体积(L) ×稀释倍数
样品重量(g)
1．2．2．2水稻叶片中Zn、Fe、Mn、Mg含量测定
在第21天时，分别取日本晴野生型和突变体yl1植株的第2片叶和第4片叶，分别105℃杀青15Min，再在80℃烘箱内将样品烘干至恒重，将样品用浓硝酸在95℃消煮2-3小时，稀释到适宜浓度（100-200mg/L）采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）分别测定Zn、Fe、Mn、Mg元素浓度。
1．2．3 抽穗期与成熟期表型观测
待日本晴野生型与突变体yl1水稻长至抽穗期对其进行拍照对比观察；并用上文所用方法测定抽穗期旗叶中叶绿素a、叶绿素b的含量；
待日本晴野生型与突变体yl1水稻长至成熟期分别对两者的株高、分蘖数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重、单株产量进行测量计算。
1．3 总DNA的提取与基因的初步定位
1．3．1 总DNA提取（CTAB法）
（1）取100mg叶片与液氮中研磨，置于2mL离心管中。
（2）加入600µl2×CTAB缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，100mM Tis-HCl，PH8.0,20mMEDTA，PH8.0），充分混匀。
（3）将离心管置于65℃水浴2-4h，混匀几次。
（4）取出离心管，室温下自然冷却，加入等体积氯仿-异戊醇混合液（24：1），彻底混匀，4℃静置30分钟，12000rpm、4℃离心10-12分钟。
（5）取400µl上清液移至1.5mL新管，加入1/10体积3MNaAc(PH4.8)和等体积预冷的异丙醇，立即充分混匀，颠倒混匀，利于DNA析出。
（6）12000rpm、4℃离心10分钟，小心移去上清。
（7）用预冷的600µl70%乙醇漂洗数次后，弃去酒精，室温晾干。