利用CRISPR/Cas9系统获得水稻ddm1突变体及其表型研究(2)
1.2.8 转基因苗的锻炼和移栽 5
1.2.9 转基因材料及其是否为突变体的验证 5
1.3 CTAB 法提取水稻材料 DNA5
2 结果与分析 6
2.1 OsDDM1 -CRISPR 靶位点的寻找与基因敲除载体的构建6
2.2 转基因操作与 Osddm1 突变体的获得.....7
2.3 Osddm1a/1b 纯合双突变体的测序鉴定.... . 7
2.4 Osddm1a/1b 纯合双突变体的表型鉴定..... 8
3 讨论 9
3.1 对 CRISPR/Cas9 系统的评价 9
3.2 水稻 Osddm1a/1b 纯合双突变体基因组的甲基化变化9
3.3 表观遗传重组自交系的建立 9
3.4 本研究的不足之处及改进方法10
致谢 10
参考文献 10
附录 11
附图 pCBSG03 质粒载体结构示意图 11
附表 1 研究中所使用的引物及其说明 1 2
附表 2 水稻成熟胚愈伤组织培养基配制方案（每升含量） 1 2
表观遗传学（ Epigenetics）是处于现代生物研究领域前沿的一门学科，它是指在 DNA序列不发生改变的前提下， 来研究基因表达的可遗传变化，属于遗传学中的一个分支。表观遗传现象有很多，其中较为典型的一种就是 DNA 甲基化。开花植物中， DNA 甲基化发生在 3 种序列环境中：对称的 CG 和 CHG 位点以及非对称的 CHH 位点（ H=A， C 或 T）； 处于这 3 种序列环境中脱氧核苷酸的胞嘧啶被添加上甲基，形成 5-甲基胞嘧啶[2]。 在每种环境中发生的甲基化均由一个特殊的 DNA 甲基转移酶家族所催化： MET1（ Methyltransferase 1， 与动物中 Dnmt1 同源）介导 CG 甲基化；植物中特有的染色质甲基化酶 CMT3（ Chromomethylase 3） 介导 CHG 甲基化； DRM2（ Domains Rearranged Methyltransferase 2， 与动物中 Dnmt3 同源）介导 CHH 甲基化。
3]有研究表明， 大量的植物甲基化现象在转座子和转座子关联基因的区域被发现， 它能够抑制转座子的表达和转座过程的发生[3]；同时， 局限于 CG 序列环境的甲基化现象也在活性基因的基因体上被发现[3][4]；除此之外， DNA 甲基化也发生在许多基因的启动子区域从而抑制基因的表达。此前有研究表明，在双子叶模式植物拟南芥中， CHH 甲基化的文持是由与 DRM2甲基转移酶活性相关的 RNA 介导的 DNA 甲基化途径（ RNA-directed DNA Methylation，RdDM）所介导的[5]。此外， DNA 甲基化也被染色质因素所影响。例如，拟南芥 SNF2家族染色质重塑因子 DDM1（ AT5G66750.1） 可以使核小体发生位置的改变[2][6]，这对正常的 DNA 甲基化是必不可少的； DDM1 的缺失能够导致一些转座子和重复序列甲基化的减少，以及转座子转录活性的增强[7][8]。 另外， CMT2 是拟南芥中一种主要的 CHH甲基转移酶， DDM1 可以促进独立于 RdDM 途径之外的 CMT2 介导的 CHH 甲基化途径[9]，也就是说， DDM1 和 RdDM 途径协同介导拟南芥中几乎所有的转座子甲基化，抑制转座并文持合理的基因表达模式。水稻（ Oryza sativa L.） 是全球多半人口赖以生存的粮食作物，对人类生活以及粮食安全等方面具有至关重要的意义[10]；同时，水稻也是经典的单子叶模式作物， 广泛应用于生物学研究。 水稻基因组经由精确测序发现， 包含了大约 40%的重复序列和转座子[11 ]；水稻的重复序列也不像拟南芥，只局限于着丝粒附近，而是广泛分布于染色质上； 除此之外，水稻基因组也包含了大量的微型反向重复转座元件（ Miniature Inverted-repeatTransposable Elements， MITEs），其中大部分都与基因相关联[12]。 同拟南芥相比，水稻还展现出了总体上与之不同的 DNA 甲基化情况，并且在全基因组， 胞嘧啶甲基化有更高的水平[13]。水稻 OsDDM1 有 2 个同源基因分别为 OsDDM1a（ Os09g27060）和 OsDDM1b（ Os03g51230），它们具有高达 93%的氨基酸同源性和相似的表达模式[14]。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9 系统为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease， ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease， TALEN)一样， 均可用于各种复杂基因组的编辑。 目前该技术广泛应用于许多物种基因组的精确修饰，修饰类型包括： 基因定点 InDel 突变、基因定点敲入、两个位点同时突变还有小片段的缺失。 除此之外， 该系统还具备很多优点： 突变效率高、制作简单及成本低等，进而被认为是一种具有广阔的应用前景的基因组定点改造分子的工具[15]。本研究依赖于 CRISPR/Cas9 技术，利用同一个靶位点， 同时敲除 OsDDM1a 和OsDDM1b 两个同源基因， 通过转基因操作技术获得 Osddm1a/1b 纯合双突变体， 观察其株高及穗发育表型。
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