1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料以‘微山湖红莲’作为试验材料,购自微山县荷都水生花卉基地。选取籽粒饱满的莲子,用枝剪经行破壳,然后置于 25 ℃恒温光照培养箱中用蒸馏水进行催芽培养 5-7天,期间隔一天换一次水,然后在日平均温度大于 25 ℃时,移至室外进行培养,用5%的 Hogland 培养液经行培养 14-18 天,期间 2-3 天换一次培养液。取其根、叶柄、叶于液氮中速冻后,放于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2 方法1.2.1 总 RNA提取1) 准备 1.5 ml离心管,121 ℃灭菌 20 min,在烘箱中将管子烘干备用;用锡纸包好研钵、研棒和勺子,烘箱中烘 4-6 h,取出烘好的研钵等冷凉待用;2) 研磨样品,取液氮冷冻的荷花样品(鲜重 1 g),在研钵中研磨至粉末状,转移至 1.5 毫升离心管中,待用;3) 将水浴锅设置为 65 ℃,把提取液(2%CTAB,2%PVP,100 mM TrisCl,pH8.0,2 M NaCl,25 mM EDTA,pH8.0)放在 65℃水浴锅预热;4) 在放入样品的1.5毫升离心管中加600 μL65℃预热好的提取液, 漩涡仪混匀30 s,放在 65℃水浴锅中水浴 2~4 min,期间涡旋震荡 3~5 次,冷却至室温备用;5) 上述混合液中每管加 600 μL 氯仿:异戊醇(v : v=24:1)进行抽提,漩涡仪震荡 5~8 min 混匀,18 ℃,10000 rpm,离心 15 min;6) 吸取上清液到新的管子,加 800 μL 的氯仿/异戊醇,漩涡仪混匀,15 ℃,10000rpm,离心 10 min;7) 吸取上清液,加入 1/4 体积的 10 M 氯化锂,充分混匀,于 4 ℃冰箱静置 16 h 或者过夜沉淀;8) 将样品 4 ℃,10000 rpm,离心 30 min;开 65 ℃水浴锅,将 SSTE(1 M NaCl,0.5%SDS,10 mM TrisCl,1 mM EDTA)在 65 ℃水浴加热;9) 去除上清液,收集沉淀,加入 500 μL 的 SSTE 缓冲液溶解沉淀;加 500 μL的氯仿/异戊醇(24:1),抽提两次至界面无明显沉淀;10)吸上清液,加入 2 倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇,混匀,-80 ℃放置30 min;11)取出-80 ℃的样品,4 ℃,12000 rpm,离心 20 min;12)弃去上清液,先后用 500 uL70%乙醇、无水乙醇漂洗沉淀,4 ℃,12000 rpm,离心 10 min;13)倒掉上清液,将沉淀在通风橱上晾干;每管加 30 μL 的 RNase-free ddH2O 溶解沉淀,琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测,获得总 RNA,于-80 ℃保存备用。
1.2.2 总 RNA中 DNA 的消化依照 DNaseⅠ(RNase-free)说明书对提取的总 RNA进行消化,消除总 RNA 中带有的少量 DNA 污染,吸取20-50 μg 总 RNA,建立如下 DNA 消化体系:
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