蚕蛹活性多肽及氨基酸的制备工艺研究(6)
2.2.3 Sephadex G-25 凝胶层析测定多肽分子量[10]
（1） 实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
操作步骤：
① 凝胶的处理
Sephadex G-25干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h，或沸水浴中3h，这样可大大缩短溶胀时间，而且还可杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒要求大小均匀，可是流速稳定。凝胶充分溶胀后用可将不易沉下的较细颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用该法除去悬浮的较细颗粒。
② 装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm 高。将处理好的凝胶用等体积的洗脱剂搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm 高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，凝胶沉积至一定高度(约70cm)即可。装柱要求连续、均匀、无气泡和无“纹路”。
③ 平衡
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍床体积的洗脱剂平衡，流速为1mL/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。
柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖—2000检查层析行为，在层析柱内加1mL(2mg/mL)蓝色葡聚糖—2000，然后洗脱，流速为1mL/min，若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2倍床体积的洗脱剂平衡。