利用酵母验证水稻基因的耐镉性(2)
ABA-胁迫-成熟诱导（ASR）蛋白是一类渗透调节蛋白家族，在逆境胁迫下，其在水稻细胞内的含量会增加，形成单体或二聚体以保护细胞膜结构，参与逆境响应。而ATP合酶广泛分布于线粒体、叶绿体的膜结构上，参与光系统的氧化磷酸化和光合磷酸化，合成ATP为生命活动提供能量。有研究表明，当水稻植株遭遇逆境时，抗逆性强的品种其光合作用仍保持较高水平，ATP合酶表达量在一段时间内降低幅度小[4]。这三个蛋白家族都与水稻耐镉有关系，故将其作为研究对象。
现在各种生化和分子的研究方法发展趋近成熟，如聚合酶链式反应技术（PCR）、琼脂糖凝胶电泳技术、大肠杆菌和酿酒酵母的转化和培养等。大肠杆菌和酵母作为常用的模式生物，是很好的外源基因表达系统，不仅繁殖迅速，易于获得和培养，操作简单，而且可以稳定地复制表达[5]，非常适合作为目的基因的扩增和验证工具。本研究以水稻中与耐镉机制相关的基因为研究对象，通过PCR技术扩增得到大量相同片段，连接上pMD19-T载体以后利用大肠杆菌感受态细胞转化得到质粒，经酶切验证后连接到目的载体pYES2上，再利用大肠杆菌，转化得到质粒，转入酿酒酵母中，挑取单菌落培养，得到菌液后配成浓度梯度溶液，在含镉培养基上培养，观察转化子的耐镉情况。
1 材料与方法
1．1 实验材料
基因材料：水稻植株的DNA
感受态细胞及菌株：大肠杆菌E.coli DH5α pMD19-T Vector购自康为世纪生物科技有限公司；酵母菌株Δycf1、yod。
其他试剂：琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，测序工作交由南京思普金生物科技有限公司，其余试剂和材料均购自国产或进口公司。
主要仪器和设备：PCR仪，离心机，电泳仪，水浴锅，超净工作台，灭菌锅，恒温震荡培养箱。
1．2 实验方法
1.2.1 目的基因的扩增与回收
PCR扩增出目的基因，反应体系为：
LA Taq polymerase 0.15 μL
dNTP 0.6 μL
5×GC Buffer 3 μL
引物1 0.6 μL
引物2 0.6 μL
cDNA 0.6 μL
ddH2O 9.5 μL
Total 15 μL
PCR程序如下：
94℃ 5 min
94℃ 30s
58℃ 30s 33 cycles
72℃ 1min
72℃ 10 min
胶回收步骤如下：
反应结束后，用中孔1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外灯下用手术刀切下含有目的条带的凝胶，放入2 ml Ep管中，加入400 μL 试剂盒中的溶胶液，55 ℃水浴约10 min，每隔2~3 min翻转混匀，使胶融化；
待凝胶融化后，将溶液转移到试剂盒中的吸附柱中，室温放置2min使其冷却，用离心机6000 rpm离心1 min，为保证回收率需倒回重复一次，弃掉废液；