以NT1的总DNA为模板,进行20μl体系的PCR温度梯度反应,退火温度为55℃-61℃;反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳结果来确定退火温度。

20μl体系的PCR反应:无菌水13.1μl,10×Buffer5μl,dNTP5μl,Mgcl2 1μl,引物各1μl,KOD酶0.4μl,NT1 0.5μl。

PCR反应条件:95℃ 3min;95℃ 30s,55℃-61℃ 30s,68℃ 30s,35个循环;68℃ 10min。

2.2.5  基因片段的克隆

分别以NT1、NT7基因组DNA为模板,扩增C4H基因部分片段。

PCR扩增反应50μl体系:10×Buffer 5μl,无菌水33.6μl,Mgcl2 2.4μl,引物94F 1μl,dNTP5μl,引物1386R 1μl,KOD酶1μl,NT1、NT7各1μl。

PCR反应条件:95℃ 3min;95℃ 30s,56.2℃ 30s,68℃ 30s,35个循环;68℃ 10min。待PCR反应结束后,分别加入0.5μl的Taq酶,72℃保温半小时。保温结束后进行琼脂糖凝胶电泳。

2.2.6 胶回收

用AxyPrep DNA胶回收试剂盒。具体操作步骤:在紫外灯下小心的切下含有目的基因的DNA琼脂糖凝胶,放入提前称过重量的1.5ml离心管中,计算凝胶的重量,并作为作为一个凝胶体积(如:100mg=100ul);加入3个体积的Buffer  DE-A,混合后放在65℃水浴锅中,每2min混合一次;凝胶完全熔化后加0.5个体积的Buffer DE-B,混匀;吸取混合液转移到DNA制备管中,10000rpm离心1min,弃滤液;加500ul Buffer W1,10000r离心30s,弃滤液;加700ul Buffer W2,10000r离心30s,源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com弃滤液;加700ul Buffer W2,10000r离心1min,弃滤液;离心1min;将制备管放到1.5ml离心管中,加25μlEluent,静置1min,10000r离心1min洗脱DNA;将DNA保存在 -20℃冰箱中。

2.2.7 目的片段与载体的连接、转化

按照TaKaRa公司提供的试剂盒进行连接与转化:DNA 4μl,pMD18-T Vector 1μl,SolutionⅠ 5μl,4℃连接过夜。加入50μl大肠杆菌作为感受态细胞源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com,放在冰上30min后在42℃水浴锅中热激45s;热激结束后立即放在冰上,时间1min。加入300μlSOC培养液,37℃、200r/min摇床预培养1小时。预培养结束后,将菌液用枪头混匀,然后涂布在含有X-Gal、IPTG、抗生素的LB固体培养基上,在37℃恒温培养箱中培养12h,形成单菌落。选择白色菌落,进行PCR确定载体中插入片段长度的大小,将阳性菌接种在含有抗生素的液体培养基中,放在摇床37℃、200r/min培养过夜。

2.2.8  测序

取灭过菌的1.5ml离心管,将菌液倒入,用封口膜把管口密封,送到公司测序。

2.2.9  基因序列的比对

通过DNAMAN软件对NT1、NT7扩增的基因序列与cDNA进行碱基比对,分析变异的位点。

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