黄瓜CsAFB基因影响拟南芥盐胁迫耐受性的研究(3)
2005年，拟南芥TIR1蛋白被确认是生长素的受体，这一发现极大的加速了生长素信号转导途径的研究[11]。拟南芥生长素受体处在生长素信号转导的关键位置，主要参与调控植物自身的生长状态，对植物抗逆境能力也有着重要的作用。水稻生长素受体基因OsTIR1和OsAFB2的下调，通过影响生长素信号通路导致水稻植株盐敏感性增高；反之，OsTIR1或OsAFB2过表达植株对盐的耐受性增强。
新的研究发现野生型拟南芥在盐胁迫环境下TIR1基因表达量上升，其超量积累提高种子萌发率和萌发速度、降低根伸长受到的抑制作用、提高植株存活率，进而提高植株的盐胁迫抗性。这表明生长素受体极大可能参与盐胁迫下的转录调控，并且提高了植株的盐胁迫耐受性。
黄瓜无需特别光周期诱导就能自主开花，营养生长期较短，作为重要的经济作物，其胁迫耐受能力非常重要。我们已克隆获得了黄瓜中的生长素受体同源基因CsAFB，但其功能尚不明确。本研究拟利用模式植物拟南芥作为研究材料，考察转黄瓜CsAFB基因的拟南芥对盐胁迫耐受性的影响；统计转基因与野生型种子在高盐培养基上的萌发率；观测比较幼苗在高盐培养基上的生长情况；测量成年植株抗逆境生理指标。期望通过本研究综合分析黄瓜CsAFB基因对拟南芥盐胁迫耐受性的影响以及潜在的作用机制，从而为其耐盐机制的研究和黄瓜生长素受体的功能研究提供新的数据，为生产实践提供参考。
1 黄瓜CsAFB基因影响拟南芥盐胁迫耐受性
1.1 材料与方法
1.1.1 实验材料
四种拟南芥株系：Columbia-0野生型，转基因纯合35S:CsAFB-1，35S:CsAFB-2，35S:CsAFB-3拟南芥。
材料的获取：将野生型拟南芥与转基因型拟南芥置于光照培养室培养，长至成熟后收取种子。（培养室的条件：22 ℃恒温，湿度60%，光照强度是10 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗长日照条件）
1.1.2 实验主要试剂和仪器
主要试剂：B5培养基（sigma），固体NaCl，丙酮，无水乙醇。
主要使用仪器：紫外分光光度计，超净工作台，恒温恒湿光照培养箱，纯水仪，pH计，镊子等仪器。
1.1.3 盐胁迫下种子萌发率统计
①配制1 L B5对照组培养基与200 ml 实验组培养基
试剂 对照组培养基 实验组培养基
B5 3.2 g 0.64 g
蔗糖 10 g 2 g
琼脂 10 g 2 g
300 mM NaCl 0 g 3.51 g
蒸馏水 1 L 200 ml
摇匀后，调PH至约5.7，高压蒸汽灭菌1.5h.
②将适量的拟南芥种子置于1.5 ml的离心管中，盖紧并分别标记。
③于超净台中操作：分别用枪头吸取1 ml 70%酒精加入离心管中混匀，3 min后小心吸除。
④分别加入1.5 ml 10% NaClO混匀，10 min后吸除。
⑤加入1 ml无菌水吹洗种子4~5遍，注意每次加入时要使无菌水与种子充分接触。注意有一些种子会漂浮在水中，在洗的过程中用移液枪慢慢吹打，并注意更换吸头，避免交叉污染。
⑥4~5遍后加入1.5 ml无菌水静置，8 min后除去水，再用无菌水清洗1~2遍。
⑦剩余约1 ml水，用灭菌的1 ml移液枪适量吸取种子并将表面消毒后的种子呈颗粒数点在含NaCl（300 mM）的B5培养基上进行培养。每个株系80颗种子，透气胶带封口后置于4 ℃的冰箱中春化2 d，破除种子休眠。
⑧将含有打破休眠后种子的培养皿置于光放置光照培养室内培养。光照强度是10000 lx，恒温22 ℃，恒湿60%，16 h 光照/8 h 黑暗长日照条件。每天统计各组种子种子萌发情况，每组实验重复3遍，统计记录数据以便分析。