3.3里氏木霉内切-1，4-β-D-葡聚糖酶II基因的克隆 18

3.3.1目的基因片段转与质粒连接 18

3.3.2转化大肠杆菌DH5a感受态 18

3.3.3重组质粒的提取鉴定 19

3.4重组质粒的测序鉴定和分析 20

结论 24

参考文献 25

致谢 27

1前言

1.1纤维素酶的概述

纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用。是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）。

细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，因此对细菌的研究较少。而真菌纤维素酶产量高、活性大，研究的也较多。

目前，能源短缺问题已经成为制约经济社会的持续发展的关键，人类开始积极探索可代替的新能源[1]。然而，每年生物质净产量约为1800亿吨。自然界中以纤维素类形式存在的生物质储存了大量太阳能，是重要的能源和资源。植物细胞壁有三种基本的结构上的生物分子组成:纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是地球上最丰富的生物高聚物。在组织中被认为是微晶结构。在生物量发酵转化成燃料和化合物过程中，纤维素分解成游离葡萄糖是主要步骤之一。

纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。纤维素酶在能源行业、食品发酵行业和环境行业已经均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。在纤维素发酵产乙醇的过程中，分步降解纤维素并最后发酵成乙醇，纤维素酶起了至关重要的作用。

1.1.1纤维素酶的分类及降解机制

纤维素酶系是一类由降解方式不同的3类酶组成:(1)内切葡聚糖酶(endol，4-p-Dglucaiiase， EC3.2.1.4，简称 EG或称为 Cx 酶);(2)外切葡聚糖酶(exol，4-p-Dglucanase， EC3.2.1.91，简称 CBH或称为 C1 酶);(3)p-葡萄糖苷酶(p-glucosidase， EC3.2.1.21，称 BG 或纤维二糖酶)，三种酶通过协同作用降解纤维素[2]。

一般来说，外切酶作用于不溶的纤维表面，使具有结晶结构的纤维素长分子链分解裂开，长分子链的末端部分进行解离，使得纤维素分子更容易水解，生成大量有非还原末端的纤维素小分子;内切酶作用于经过外切酶作用的纤维素小分子，使其内部的β-l，4糖苷键水解，生成纤维二糖与纤维寡糖等短链低聚糖;β-l，4糖苷键把这些短链低聚糖继续降解为两个葡萄糖分子。（表1[3]为纤维素酶的分解机制以及分子量）

1.1.2纤维素酶的结构

纤维素酶分子一级结构同源性是比较低的，但是一般是由具有催化功能的核心催化域(catalytic domains，CD )和具有与纤维素结合功能的纤维素结合域(cellulosebinding domains，CBD)以及将这两部分连接的高度糖基化的连接桥(linker)三部分组成 [4]。

1.2里氏木霉的概述

产纤维素酶的霉菌菌种有木霉属、根霉属和曲霉属等[5]，所产纤维素酶通常在中偏酸性的环境下作用于纤维素底物，并协同作用分解纤维素。木霉是一类普遍存在于各种气候带常见的丝状真菌。它们主要包括绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉和拟康氏木霉等。木霉属真菌分泌的纤维素酶系更加全，产量更加高，而且还能分泌到胞外[6]。