1.2.1里氏木霉产纤维素酶的概况

里氏木霉是一种腐生型的真菌，能利用多种氮源以及碳源生长，这就需要里氏木霉具有多种生物合成和降解途径，因此里氏木霉能够产生多种初级和次级代谢产物。同时，里氏木霉具有良好的多种大分子物质降解酶系的分泌能力，例如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶。里氏木霉所产纤维素酶和半纤维素酶包括:内切葡聚糖酶I (EGI)、EG II， EG III，外切纤维素酶I (CBHI)、CBH II，木聚糖酶I (XYLI)，XYL II， β-木糖苷酶，a-L阿拉伯呋喃糖酶，乙酰基木聚糖酯酶，甘露聚糖酶，半乳糖苦酶，木葡聚糖酶，聚半乳糖醛酸酶，内切β-l，3葡糖苷酶[7]。

在里氏木霉分泌的高效且大量的纤维素酶中，胞外纤维素酶系内，外切葡聚糖酶占60%-80%，内切葡聚糖酶占20%-36%，β-葡聚糖苷酶占1%，它们协同作用于纤维素使之降解成葡萄糖[8]。

1.2.2里氏木霉的研究动态

里氏木霉在工业化规模的酶生产中的安全实施已有很长的历史。它生产的纤维素酶和木聚糖酶被应用在食品、动物词料、药品、纺织品和纸浆造纸业。里氏木霉的次级代谢物中有毒的代谢产物产生具有菌株特异性和环境依赖性[9]。它一般被认为是可以安全生产内源酶的微生物,对于其他无害的基因产物也是一个安全的宿主[10]。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1质粒和菌株

研究所用的出发菌株为淮阴师范学院生命科学学院保留的里氏木霉菌种，克隆质粒pGH-T simple质粒购买自上海捷瑞生物工程有限公司；感受态由大肠杆菌DH5a由本实验室保存。

2.1.2主要仪器及设备

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司

SPX-250B生化培养箱：上海佳胜实验设备有限公司

HD-930型组合式全温摇床：太仓市博莱特实验仪器厂，

电子天平BS210S：北京赛多利斯天平有限公司

高速冷冻离心机HR21M：湖南赫西仪器设备有限公司

HD-930DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司

DYY-10C型凝胶电泳仪器：北京市六一仪器厂

PCR仪 eppendorf公司

雷磁pHS数显pH计:上海精密科学仪器有限公司

ZF1-Ⅰ多功能紫外分析仪：上海汗诺仪器有限公司

Universal HoodⅡ凝胶成像仪 ：Bio-Rad

HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司

EPED-E2-10TF纯水仪：南京易普易达科技发展有限公司

SH2-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂

WH-3微型漩涡混合仪：上海泸西分析仪器厂有限公司

FM-50型雪花制冰机：上海比郎仪器有限公司

MS300磁力搅拌器：上海般特仪器有限公司

2.1.3酶和主要试剂

限制性内切酶EcoR I、NotⅠ和T4 DNA Ligase购自纽英伦生物技术（北京）有限公司

PCR所用试剂及Taq酶购买自regene公司

DNA Marker DL2004D、和 质粒小量制备试剂盒（离心柱型）以及Genclean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

引物合成来自华大基因。

2.2试验方法

2.2.1主要试剂以及培养基的配制

1、PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、MgSO4.5g、K2HPO4 1.5g、蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20分钟。

2、LB培养基(1L)：胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化钠(NaCl) 10g、pH7.0左右，121℃灭菌20分钟。

3、CTAB提取液:氯化钠(NaCl)1.4mol/L 、CTAB(W/V)2%、Tris.Cl(pH8.0)100mmol/L、EDTA(pH8.0)20mmol/L、巯基乙醇(v/v)0.2%