木霉13-1的生物功能分析+文献综述(2)
1. 实验部分
1.1 材料和仪器
1.1.1 实验材料
大豆品种为“周豆17”，由植物遗传与分子育种重点实验室提供；木霉13-1是由芦荟根部土壤中分离纯化而来，经鉴定为哈茨木霉，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）平板上28℃培养7d待用；核盘菌分离自田间大豆核盘菌病株并置于PDA培养基上于28℃培养3d待用。
1.1.2 仪器设备
三孔恒温水浴锅（SM-8D）：南京舜玛仪器设备有限公司；
移液枪：Eppendorf，中国有限公司；
超净工作台：苏州宏瑞净化科技有限公司；
冰箱：BCD-226SDM，青岛海尔股份有限公司；
pH 计：PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司：
恒温培养箱：Eptisa中国有限公司；
高速离心机：5804R/5417R，Eppendorf中国有限公司；
电子天平：PL-230，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
紫外分光光度计：Spectrumlab 752 Pro；
台式恒温振荡器：上海精宏实验设备有限公司；
立式压力蒸汽灭菌器：LS-35HJ-型，江阴滨江医疗设备有限公司。
1.1.3 试剂
无水乙醇、CaCO3、石英砂、1000µg/mL标准牛血清蛋白、草酸钠、乙酸乙酯、连二亚硫酸钠（俗称保险粉）、67mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、0.5mol/L pH5.5磷酸缓冲液、0.1mol/L儿茶酚、20%三氯乙酸（TCA）、0.05mol/L愈创木酚溶液、2%H2O2、0.5%硫代巴比妥酸。
80%丙醇：80mL丙醇溶液+20mL蒸馏水，混匀。
100mg/L考马斯亮蓝G-250试剂：100mg试剂溶于50ml90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。
饱和醋酸铅：称取适量醋酸铅粉末溶于稀硫酸溶液中，加入粉末直至溶液中有晶体析出，即为饱和醋酸铅溶液。
1g/L蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，用稀硫酸溶液（由760mL比重为1.84的浓硫酸加到300mL水中）溶解并定容至1000mL。测定时新鲜配置。
200mg/L葡萄糖标准溶液：称取100mg已在80℃烘箱烘至恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解，即得200mg/L的葡萄糖标准溶液。此液放入冰箱中保存，使用前1h取出回升至室温。
1mol/L H2SO4：用量筒量取比重1.84的浓硫酸55mL，边搅拌便加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000mL。
0.4mol/L琥珀酸钠：称取琥珀酸钠（含6个结晶水）10.81g，溶于蒸馏水中，定容至100mL。
1.2 方法
1.2.1 木霉13-1菌及核盘菌和的活化
在无菌操作台上用高温灭菌过的接种针挑取适量木霉13-1菌及核盘菌菌丝接种到PDA固体平板上，于25℃的培养箱中培养2d，之后第二次活化进行生孢培养，将孢子接种于PDA液体培养基溶液上，于摇床上28℃，200r/min培养3d待用。
1.2.2 周豆17的播种
在对菌株进行活化的同时，对培养土进行灭菌，之后分装到盆中，大豆用蒸馏水浸泡3个小时后播种到盆中，每盆3颗大豆种子，共48盆。
1.2.3木霉菌株代谢产物溶液的制备
取108个木霉孢子接种于PDA培养基，28℃，200r/min培养7d后，将孢子液用16层纱布过滤，获得木霉代谢产物溶液。
1.2.4 大豆幼苗的浇灌处理
木霉代谢产物均匀浇灌大豆幼苗根部，每株浇灌200mL，每个处理24个重复，并用培养基浇灌做对照，每隔5d浇灌一次，处理7次，40d后测量各种指标。
1.2.5 大豆叶片接种核盘菌
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片，放入培养皿中接种核盘菌，一周后统计发病率。
1.2.6 大豆叶片胁迫处理
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片，放入含有CaCl2和NaCl溶液中的培养皿中，浓度依次为0mmol/L和150mmol/L，胁迫时间为1d，采用NBT（氮蓝四唑）、埃文斯蓝（Evans blue）染色和DAB（二氨基联苯胺）染色，同时，进行MDA含量的测定，采用研磨法提取。