木霉13-1的生物功能分析+文献综述(3)
1.2.7 大豆叶片生理指标的测定
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片进行植物叶片中叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、PPO活力和POD活力的测定。
植物叶片叶绿素含量的测定：
1. 称取剪碎的大豆叶片新鲜样品0.3g，放入研钵中，2mL80%丙醇，迅速研磨，将匀浆将倒入2mL EP管（eppendorf管）中，5000r/min，10min离心，抽提几次。
2. 用无水乙醇定容上清液至25mL。
3. 把叶绿素提取液摇匀后倒入比色杯中（厚度约为1cm），以80%丙醇作对照，分别在波长645nm、652nm和663nm下测定光密度值，最后计算。
植物叶片中可溶性蛋白质含量的测定：
1. 标准曲线的绘制
0-100µg标准曲线的制作，取依次编号1-6的试管优尔只，，分别加入1000µg/mL标准牛血清蛋白0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL；蒸馏水5mL、4.9mL、4.8mL、4.7mL、4.6mL和4.5mL；试管1-6中蛋白质含量分别为0µg、20µg、40µg、60µg、80µg和100µg。准确吸取所配的各管溶液0.1mL，分别放入10mLEP管中，并加入5mL考的马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，放置2min后，测定在595nm处的吸光度值，绘制标准曲线。
2. 酶液的提取
称取重约0.5g的大豆叶片，加入5mL预冷的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液，在冰浴下快速研磨成匀浆（注研钵需要提前预冷），5000r/min离心10min（2~4℃），上清液为样品的提取液。吸取0.1mL样品的提取液，按上述方法操作，测得溶液在595nm处的吸光度值，根据标准曲线查出相应的蛋白质浓度。
3. 结果计算
植物叶片中可溶性糖含量的测定：
1. 绘制标准曲线
（1）配置浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/L。
（2）分别吸取上述糖溶液1mL，分别放入EP管中，并加入蒽酮试剂5mL，充分混匀，将装有溶液的EP管煮沸10min，取出冷却。
（3）测反应液在波长为620nm处的吸光值。
（4）用测量结果绘制标准曲线。
可溶性糖含量的测定
1. 可溶性糖的提取：
（1）称取重约0.5g的大豆叶片，剪碎，加入少许乙醇，研磨，研磨液用移液器转移到EP管中，用约70℃的热水洗涤研钵，洗液并入EP管中，再加蒸馏水3~4mL。EP管水浴约30min 70~80℃。
（2）待溶液冷却后，进行除去混合液中的蛋白质的操作，加入醋酸铅至不再形成白色沉淀为止。
（3）离心5000r/min 10min，取上清液，在上清液中加入少量草酸钠粉末，使生成草酸铅沉淀，离心5000r/min 10min，留上清液。
2. 可溶性糖含量的测定
吸取可溶性糖的提取液1mL，放入EP管里，并加入蒽酮试剂5mL混合，放于沸水浴中煮沸10min，取出冷却。然后在分光光度计波长620nm处测定吸光值，,再从标准曲线上查得提取液中糖的浓度。
多酚氧化酶活力测定：
1. 酶液的提取
称取0.3g大豆叶片，剪碎，加入3mL的0.1mol/L、pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，进行几次离心抽提，总上清液加入30%饱和度硫酸铵，离心取上清液，后加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。沉淀用2~3ml 0.01mol/L、pH6.5磷酸缓冲液溶解。
2. 活性酶的测定
在EP管中加入3.9mL的0.05mol/L pH5.5磷酸缓冲液、1.0mL 0.1mol/L儿茶酚，水浴37℃ 10min，取出后加入0.5mL酶液，迅速摇匀，于525nm波长测在1~2min内吸光度变化（A）值。