摘  要 ：将内切葡聚糖酶基因egl2与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαB连接形成的重组载体（pPICZαB-egl2）导入大肠杆菌（Escherichia coli ）DH5α菌株，挑取阳性克隆，提取质粒，再将重组载体用BstXI酶切，线性化后电转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115菌株，挑取多个阳性克隆，将重组菌株接入BMGH和BMMH培养基中振荡培养，经甲醇诱导后高效表达内切葡聚糖酶，并从中筛选出高产内切葡聚糖酶的菌株PE-21，CMC酶活力达到2394.1±25.5U/ml。65058

关键词：内切葡聚糖酶，pPICZαB， 巴斯德毕赤酵母，表达

Abstract: In this study, Pichia pastoris expression vector pPICZαB-egl2 with endoglucanase gene egl2 was constructed and transformed into E.coil. The recobinant vector was extracted and linearized by BstXI hydrolysis. Then the linearized pPICZαB-egl2 vector was transformed into Pichia pastoris strain GS115 by electro transformation. Positive clones were selecterd and inoculate into BMGH and BMMH cultures for high-efficiency expression of endoglucanase EG-2 induced by methanol. Strain PE-21 with high-yield endoglucanase production was screened, whose CMCase activity was 2394.1±25.5 U/ml. 

Keywords：endoglucanase，pPICZαB，Pichia pastoris，expression

目录

1  前言 7

1.1  纤维素酶概述及动态研究 7

1.2  里氏木霉概述 7

1.3  毕赤酵母表达体系 8

2  材料与方法 9

2.1  材料 9

2.1.1  质粒和菌株 9

2.1.2  主要仪器和设备 9

2.1.3  酶和主要试剂 10

2.2  方法 10

2.2.1 主要试剂及培养基的配置 10

2.2.2  目的基因的提取 11

2.2.3  目的基因与载体的结合 11

2.2.3.1  酶切 11

2.2.4  目的基因和表达载体的连接及克隆 12

2.2.4.1  的基因和表达载体的连接 12

2.2.5  重组子导入受体细胞 12

2.2.5.1  连接并转化大肠杆菌DH5α 12

2.2.5.2  重组子的线性化处理并回收 13

2.2.5.3  巴斯德毕赤酵母GS115菌株感受态的制备及电转化 13

2.2.5.3.1  制备方法： 13

2.2.5.3.2  巴斯德毕赤酵母的GS115电转化 13

2.2.5  目的基因的表达和检测 14

2.2.5.1  重组毕赤酵母的筛选和鉴定 14

2.2.5.2  重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 14

2.2.5.3  重组毕赤酵母工程菌株PE的酶表达检测 14

3  结果 14

3.1  表达载体的提取 14

3.2  毕赤酵母表达载体的构建