摘 要：本实验通过利用质粒pPICZaB和外切葡聚糖酶基因(CBH2)来构建表达载体pPICaB-CBH2，用BstXⅠ酶对表达载体进行线性化酶切，然后通过电击法把线性化后的表达载体转入巴斯德毕赤酵母感受态中，用甲醇进行诱导表达，检测重组菌株产酶的能力，从中筛选出一株产酶能力较高的重组菌株，其FPA酶活力达到17.68 ±0.32U/ml。65059

毕业论文关 键 词：外切葡聚糖酶；pPICaB；巴斯德毕赤酵母；CBH2基因；表达

Abstract: In this study, cellobiohydrolase gene CBH2 was inserted into Pichia pastoris vector pPICZαB to construct expression vector pPICZαB – CBH2. Then the recombinant vector was digested by BstXⅠ to be linearized and transformed into Pichia pastoris GS-115 via electroporation. Induced by methanol, the recombinant cellobiohydrolase was highly expressed by GS-115 transfomants. One of the transformants was screened through FPAse acitivity determination, whose FPAse activity was 17.68 ±0.32U/ml.   

Keywords：Cellobiohydrolase；pPICaB；Pichia pastoris；CBH2；expression

目  录

1  前言 4

1.1  纤维素酶的概述 4

1.2  纤维素酶目前的研究状况 4

1.3  巴斯德毕赤酵母极其表达系统研究现状 4

2  材料与方法 5

2.1  材料 5

2.1.1  质粒和菌株 5

2.1.2  主要仪器和设备 5

2.1.3  酶和主要试剂 6

2.1.4  主要主要试剂以及培养基的配制 6

2.2  方法 7

2.2.1  表达载体pPICZαB-CBH2的构建 7

2.2.1.1   pPICZαB质粒的获得 7

2.2.1.2  目的基因CBH2的获得 7

2.2.1.3  质粒和目的基因双酶切 7

2.2.1.4  大肠杆菌感受态DH5a的制备 8

2.2.1.5  质粒和目的基因的连接并转化大肠杆菌DH5α 8

2.2.2.1  质粒的线性化处理并回收 9

2.2.2.2  巴斯德毕赤酵母DH5α感受态的制备 9

2.2.2.3  巴斯德毕赤酵母DH5α的电转化 9

2.2.3  pPICaB-CBH2的表达和活性检测 10

2.2.3.1  重组毕赤酵母的筛选和鉴定 10

2.2.3.2  重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 10

2.2.3.3  重组毕赤酵母工程菌株的酶表达检测 10

3  结果 11

3.1  pPICZαB质粒的提取 11

3.2  外切葡聚糖酶基因(CBH2)的获得 12

3.3  质粒和目的基因的酶连并转化大肠杆菌DH5α 13

3.4  质粒的线性化处理并回收 14

3.5  重组毕赤酵母的筛选和鉴定