结  论 17

参 考 文 献 18

致  谢 19

1  前言

1.1  纤维素酶的概述

纤维素是世界上最丰富的、可再生的碳水化合物资源，但是由于纤维素难于分解致使其利用率极低。纤维素酶可降解纤维素成葡萄糖，是一种重要的复合酶产品，在食品、酒精、饲料和纺织等领域已广泛利用并取得了可观的经济效益，已经成为我国酶制剂工业中的一个新的增长点。长期以来，人们通过大量筛选获得了一批可对纤维素具有高降解能力的微生物菌株，并通过优化发酵条件提高微生物的产酶能力[1]。

纤维素酶是一种糖苷水解酶，目前学术上将其分为外切葡聚糖酶基因，内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶等三类。

1.2  纤维素酶目前的研究状况论文网

目前对纤维素酶的结构和功能研究主要分成两个方向，即一种研究方向是纤维素外切酶的研究；另一种研究方向是纤维素内切酶的研究。纤维素外切酶裂解不溶性纤维使其长链末端暴露，从而水解纤维素；纤维素内切酶作用的位置是纤维素分子内的β-1，4-糖苷键，使纤维素裂解为二糖和三糖等。但目前由于自然界所产纤维素酶活性较低，所以目前的研究重点还是在纤维素酶的研究开发[2,3]。

因此为了提高纤维素酶的产量，最主要的是外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的研究，所以要通过改造提高里氏木霉产纤维素酶的能力，进行外切葡聚糖酶基因(CBH2)的相关研究。

1.3  巴斯德毕赤酵母极其表达系统研究现状

2  材料与方法

2.1  材料 

2.1.1  质粒和菌株

大肠杆菌感受态DH5α为自己所做，含有CBH2基因的质粒购自于无锡青兰生物科技有限公司，酵母表达载体pPICZαB为本实验室上届师兄所留保存在大肠杆菌中，巴斯德毕赤酵母菌株为本实验保存。

2.1.2  主要仪器和设备

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司

SPX-250B生化培养箱：上海佳胜实验设备有限公司

HD-930型组合式全温摇床：太仓市博莱特实验仪器厂

电子天平BS210S：北京赛多利斯天平有限公司

高速冷冻离心机HR21M：湖南赫西仪器设备有限公司

HD-930DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司

DYY-10C型凝胶电泳仪器：北京市六一仪器厂

雷磁pHS数显pH计:上海精密科学仪器有限公司

ZF1-Ⅰ多功能紫外分析仪：上海汗诺仪器有限公司

Universal HoodⅡ凝胶成像仪 ：Bio-Rad

HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司

EPED-E2-10TF纯水仪：南京易普易达科技发展有限公司

SH2-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂文献综述

WH-3微型漩涡混合仪：上海泸西分析仪器厂有限公司

FM-50型雪花制冰机：上海比郎仪器有限公司

MS300磁力搅拌器：上海般特仪器有限公司

电转移：eppendorf公司

2.1.3  酶和主要试剂

限制性内切酶Kpn I、Not I和T4 DNA Ligase购自纽英伦生物技术（北京）有限公司

DNA Marker DL2004D、和质粒小量制备试剂盒（离心柱型）以及Genclean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

2.1.4  主要主要试剂以及培养基的配制