本实验以里氏木霉的总基因组为模版，已通过引物设计PCR出内切葡聚糖基因保存于PMV载体中，供实验原材料。

1.3  毕赤酵母表达体系

 巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。文献综述

毕赤酵母表达系统具有以下优势：1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；5）外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

本实验中，选取巴斯德毕赤酵母表达系统，因为其为理想的真体外核蛋白表达系统，具有受甲醇调控的AOX1基因强启动子。而pPICZαB能与egl2进行T4酶的连接形成pPICZαB-egl2，经BstXI线性化后导入巴斯德毕赤酵母中能稳定高效表达外源蛋白, 进行加工、折叠、翻译后修饰，并将其分泌到培养基中，毕赤酵母产生的自身分泌蛋白很少，使外源蛋白的分离纯化较为简便。构建的巴斯德毕赤酵母体系高效表达的内切葡聚糖酶与其他两种酶配合起来，能够高效的把纤维素转化为单糖，然后作为生物质能源生产的原料，供后续研究。

2  材料与方法

2.1  材料

2.1.1  质粒和菌株

    包含有里氏木霉内切葡聚糖基因egl2的PMV-egl2质粒、大肠杆菌DH5a菌株均为本实验室保存。毕赤酵母表达系统（包含表达载体pPICαB、毕赤酵母GS115菌株）购自英国NEB公司。

2.1.2  主要仪器和设备源.自/优尔·论\文'网·www.youerw.com/

    2S-75HJ型高压灭菌锅                     江阴滨江医疗设备有限公司

    HD-930型组合式全温摇床                  太仓市博莱特实验仪器厂