本研究以水稻品系为试验材料,分别采用定性及定量PCR方法,对CaMV35S启动子基因进行检测分析,来判断该水稻是否为含有转CaMV35S启动子基因的转基因产品。

2  材料与方法

2.1  材料

阳性质粒DNA(含有CaMV35S基因),待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2  试剂与耗材

    DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3  仪器设备 

普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽及电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4  方法文献综述

2.4.1  DNA的提取与纯化 

操作步骤

1)将水稻颗粒使用美的搅拌机(MJ-BL25B2)粉碎成粉末状,称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中,加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml),涡旋振荡1分钟,使其充分裂解。

2)65℃孵育10分钟,期间涡旋混匀2~3次。

3)加入130μl Buffer GF2,混匀,冰上孵育5分钟。

4)将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中,14000rpm离心2分钟,收集滤液。

5)将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。

6)加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇),充分混匀。

7)将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若一次不能加完                 溶液,可多次转入,10000rmp离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放入收集管中。

8)向吸附柱中加入500μl Buffer GW(使用前检查是否已加入无水乙醇),10000rpm 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

9)重复步骤8。

10)12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。

11)将吸附柱放到一个新离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,10000rpm离心1分钟,收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2  引物序列 来~自^优尔论+文.网www.youerw.com/

根据引物合成的原则,通过使用引物合成软件,分别合成定性及定量引物,

引物序列详见下表。

2.4.3  PCR检测 

1、定性PCR扩增

    PCR是一种体外DNA 扩增技术,经过模板高温解链变性,引物退火结合到单链DNA和在酶的作用下引物延伸三个步骤,使得DNA片段在体外呈指数增加的实验技术,该技术能在短时间内获得大量特定的基因片段[8]。本研究根据实验室的一贯实验习惯,采用25ul反应体系进行PCR扩增

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