三种植物叶片光合作用日变化及碳氮含量比较研究(4)
2．1.3 实验主要应用仪器
超轻型便携式光合作用测定仪CI-340、烘箱、天平、研钵、752型紫外光可见分光光度计、离心机、SKD-100凯氏定氮仪、HH-8数显恒温水浴锅。
2.2实验方案及测定方法
2．2.1 叶片光合作用测定
在植物园内选取发育健康，枝叶茂盛的三株常绿植物，保证植物周围环境开阔，能接受到阳光的照射。在连续三天内固定五个时间点分别为08：00、10:00、12:00、14:00、16：00，按照金边大叶黄杨、栀子、椤木石楠的顺序测量。使用超轻型便携式光合作用测定仪CI-340来记录光合作用时的数据，包括叶片温度，二氧化碳的交换量和Pn将光合作用速率，单位为毫摩尔每升。
在每天测定完五个时间点后，所测叶片迅速摘下送到第二学科楼四楼实验室烘干箱内烘干为后续室内实验做提前准备，固定叶片内干物质。同时取下最靠近所测叶片的新鲜叶片，立即到实验室进行叶绿素含量测定的实验。
2.2.2 叶绿素的提取和含量测定
新鲜的叶片摘下后，需要提取叶片内的叶绿素。具体的步骤是
（1） 取新鲜叶片0.5g
（2） 研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉末，加3ml95%乙醇，研磨至糊状，再加15ml95%乙醇，静置3-5分钟。
（3） 取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒吧提取液倒入漏斗，滤液流至25毫升棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、玻璃棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
（4） 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部吸入棕色容量瓶中。置于暗处保存。
最后来计算叶绿素的含量，在测量D663和D645波长下的吸光度值后用以下公式测量出叶绿素的含量。
Chla=(12.7D663-2.69D645)*V/W
Chlb=(22.9D645-4.63D663)* V/W
V:体积25ml W：叶片鲜重g
2.2.3蒽酮法测量叶片糖和淀粉的含量
实验原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖含量呈正比，所以可以用来糖分的测定。
试剂：（1）80%乙醇溶液
（2）0.1mol/L 氢氧化钠溶液
（3） 葡萄糖标准溶液：称取分析纯葡萄糖（预先于80℃下烘干至恒重）100mg，溶于蒸馏水中，定容至100mL，即为1mg/ml标准溶液，即为100ug/ml 标准液.
(4) 蒽酮-硫酸试剂：用天平称取0.2g蒽酮放置在烧杯中，缓缓加入100ml浓硫酸，搅拌溶解后应成淡黄色透明溶液，随配随用。
提取分离步骤
1、 将植物叶片烘干，称取植物干叶片0.050g，放置在研钵中研磨成粉状装袋待用。
2、 将粉末状叶片放入离心管，加入5ml80%乙醇溶液，80℃水浴二十分钟，期间不时搅拌。用少量80%乙醇冲洗玻璃棒，并将溶液冷却到室温后在离心机用3500转离心十分钟
3、 将离心后的溶液上清液提取10ml转入25ml容量瓶中并定容至刻度线。
糖和淀粉的测定
1、 制作标准曲线：取5支25ml试管编号，按照图表加入葡萄糖标准液和蒸馏水。加完试剂后摇匀，在沸水浴中加热五分钟，取出后立即用流水冷却，加蒸馏水定容至20ml，以1号试管为空白条令，在540nm波长下比色测定。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，位置或求出标准曲线
2、 样品中可溶性糖含量的测定：在容量瓶中取1ml提取液，放入5ml蒽酮-硫酸试剂。在加蒽酮-硫酸试剂的时候么最好将试管放在冰水浴中，并沿管壁缓缓加入，待全部加完后再混匀。将标准管和样品管同时放入100℃水浴中准确加热10min，取出后用自来水冷却至室温后测定620nm波长下的吸光度，并记录620nm波长下的吸光度
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