牡丹ISSR反应体系的优化研究+正交试验设计(3)
1.2.2 分子标记的分类
目前，分子标记大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交技术为核心的分子标记技术，最具代表性的就是限制性片段长度多段性(Restriction fragment length polymorphism,RFLPs)和DNA可变串联重复数标记(Variable number of tandem repeats,VNTRs);第二类是以PCR技术为核心的分子标记技术，目前这一类应用最为广泛，主要包括随机扩增多态性(Randomly amplified polymorphism DNA,PARD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphisms,AFLP)、序列特异扩增区域(Sequence characterized amplified region,SCAR)、简单重复序列区间(Inter simple sequence repeat,ISSR)、序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)、简单重复序列(Simple-sequence repeat,SSR)、微卫星多态位点选择性扩增(Selective amplification of microsatellite polymorphic Loci,SAMPL)、随机扩增卫星多态性(Random amplified microsatellite polymorphism,RAMP)、DNA扩增指纹(DNA amplification fingerprinting,DAF)、序列标签位点(Sequence tagged site,STS),酶切扩增多态性(Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)、DNA单链构象多态性(Single strand conformation polymorphisms,SSCP)、反转录转座子间扩增多态性(Inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)等；第三大类是以DNA序列特征(基因芯片技术)为核心的分子标记，如表达序列标签(Expressed sequence tags,EST)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)、核苷酸绑定位点(Nucleotide binding site,NBS)、特定序列扩增多态性(Sequence-specific amplification polymorphism,SSAP)和抗性基因类似物(Resistance gene analogues,RGA),是目前分子标记的研究热点。
根据分子标记的扩增特点，可以将上述分子标记分为显性标记和共显性标记。显性标记有PAPD、ISSR等；共显性标记有RELP、SSR、SAMPL、RAMP、CAPS、SSCP、SNP、EST-SSR、NBS和SSAR等。另外，AFLP和SRAP既可以扩增出显性标记位点有可以扩增出共显性标记位点。就作图效果及图谱的应用价值来说，共显性标记是最理想的标记。特别是在比较基因组学研究、物理作图等方面，共显性标记具有不可替代的作用。然而，在实际研究中，开发共显性标记的前提一般都要需要大规模的基因组测序，代价比较昂贵。一般只在一些经济地位比较重要的大农作物和经济作物中报道较多。
1.3 分子标记在牡丹研究中的应用
我国牡丹种质资源丰富, 但由于对其遗传背景、亲缘关系缺乏深入系统的研究, 育种工作受到限制。近十多年来, 分子标记技术已逐渐应用于牡丹种和栽培品种的亲缘关系的研究、遗传多样性研究、指纹图谱构建、品种鉴定等方面。
目前，应用于牡丹研究中的分子标记有 RAPD、SSR、ISSR、AFLP和 SRAP等，下文分别介绍了各方法的原理和特点。
1.3.1 RAPD标记
RAPD(Randomly Amplified Polymorp－hic DNAs)是 1990年由 Williams等[4]发明的一种分子标记技术，是由 10个碱基构成随机引物，对基因组 DNA进行扩增，以得到多态性条带，其在遗传图谱构建、亲缘关系分析、基因定位等方面得到广泛应用，具有快速、简单、成本低、分辨率高等优点，但由于对基因组随机扩增导致其稳定性较差。RAPD标记技术已应用于野生牡丹居群内与居群间的遗传变异、牡丹亲缘关系分析、种或品种的分类鉴定等方面的研究。Hosoki等[5]对19个中国牡丹品种进行了RAPD分析，经聚类分为4组，与其他基于花型或花色的分类结果并不完全一致。对不同花色牡丹品种亲缘关系的RAPD分析表明，来源相同，花色一致的品种之间亲缘关系相对较近，但产地来源对品种亲缘关系的影响比花色更为突出。革质花盘亚组各野生种与栽培种间RAPD分析显示，亲缘关系由近及远依次为:杨山牡丹、四川牡丹(P．decomposita)、卵叶牡丹(P．qiui)、紫斑牡丹(P．rockii)和矮牡丹[6]。邹喻苹等[7]对7个牡丹野生种的RAPD研究表明，滇牡丹与大花黄牡丹聚为一组;矮牡丹、紫斑牡丹、杨山牡丹、卵叶牡丹、四川牡丹聚为一组，完全支持了洪德元的形态分类结果。