牡丹ISSR反应体系的优化研究+正交试验设计(9)
引物浓度对牡丹扩增结果影响也较大，在引物浓度为0.25μmol•L-1时扩增条带较少且不清晰；0.5μmol•L-1时都没有条带；在0.75μmol•L-1和1.0μmol•L-1时扩增效果较好（图3-4）。
3.2.4 不同模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
所选模板DNA浓度扩增效果都不错，考虑到节约用量及过低误差较大，选模板DNA浓度为20ng（图3-5）。
3.2.5 不同Taq酶浓度对ISSR扩增的影响
在20ul反应体系中，使用0.5，1.0，1.5，2.0U的Taq DNA聚合酶均能扩增出条带，0.5U 用量时最稳定，而1.0-2.0U用量时扩增的条带稳定性较低（图3-6）。
图3-5 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
1-4 模板DNA浓度10，20，30，40 ng
Fig.3-5 The results of ISSR-PCR with different concentration of template DNA
The template DNA concentration from 1 to 4 are 10，20，30，40 ng respectively
图3-6 Taq酶浓度对ISSR扩增的影响
1-4 Taq酶浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 U
Fig.3-6 The results of ISSR-PCR with different concentration of Taq Polymerase
The Taq DNA Polymerase concentration from 1 to 4 are 0.5,1.0,1.5,2.0U respectively
从上述实验结果建立牡丹ISSR最优化反应体系为：总体积20ul， Taq聚合酶浓度为0.5U；模板DNA浓度为20ng；Mg2+浓度为3.0mmol/L；dNTPs浓度为400μmol/L；引物浓度为1.0μmol/L
4 讨论
4.1 牡丹叶片DNA提取
植物材料的老嫩度对基因组DNA提取的影响很大，牡丹DNA的质量直接影响PCR反应的质量。通常情况下，嫩叶DNA提取较容易；成熟老叶因其叶中多酚、多糖等高分子物质明显增多，使得提取较高质量的DNA困难。实验表明，研磨叶片时加少量PVP（最好不溶性的）和抗坏血酸（Ve）、较高浓度的CTAB提取液等（含有4%硫基乙醇及2%PVP）均有利于去除老叶中的多糖和多酚物质。沉淀是采用异丙醇效果好于无水乙醇（嫩叶正好相反）。因异丙醇更易于沉淀小分子量物质，减少多糖等高分子物质的沉淀。DNA中的RNA消化对PCR反应的影响很小。
本实验也发现，当采用牡丹的成熟叶片为材料时，其DNA提取的难度明显比幼嫩材料的加大，首先材料越老越难磨碎，而研磨时间太长，将导致DNA降解;其次是去除多糖、蛋白质等次生物质的难度更大。幼嫩植物材料的采摘往往受季节性的影响，有时也不得不采用相对成熟的植物组织来提取DNA，依据本实验的经验，尽管材料越老，DNA提取的难度越大，产量也越低，但仍可设法获取高质量的DNA。
4.2 牡丹ISSR-PCR反应体系
在该PCR反应体系中，DNA模板用量过少，引物与模板结合机率降低，导致扩增产物的稳定性下降；用量过多，又可能将模板中杂质过多地带入反应体系，导致扩增产物稳定性下降,或导致过量扩增，使电泳图谱呈弥散状[19]。通常DNA用量很小，只要够用即可，量多反而可能因杂质多而起反作用，在DNA模板不很纯的情况下，宁可使用有效浓度范围内的最低极限。本研究表明：牡丹ISSR体系具有较宽的模板用量范围，在20ng/20μl就可以扩增出较好条带，大大节约了模板用量。
dNTP 是反应中磷酸基团的主要来源，传统的筛选试验认为dNTP的浓度过低会导致无扩增产物或扩出来的条带不清晰；浓度过高则错误掺入率增强。此外，由于dNTP直接螯合相应数量的Mg2+，它的浓度改变都会影响有效Mg2+ 的浓度[20,22]。我们在试验过程也发现当dNTP浓度低时扩增条带减少和变淡。
PCR反应中，Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率，是ISSR-PCR 反应中的一个主要变化因素，许多植物Mg2+浓度为1.5-2.0 mM.L-1 时扩增效果较为理想 [21]。我们在研究中发现Mg2+ 浓度为1.5 mM.L-1时扩增条带较弱，这可能是Mg2+ 浓度过低而导致对Taq 酶激活作用不强的缘故。