牡丹ISSR反应体系的优化研究+正交试验设计(4)
1.3.2 SSR标记
SSR(simple sequence repeat)广泛存在于真核植物基因组中，一般由1～6个碱基对组成，其两端序列一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计特异的寡核苷酸引物进行 SSR-PCR，以扩增串联重复序列，根据串联重复数的不同来揭示 SSR的长度多态性[8]。SSR标记具有数量丰富、多态性高、共显性、扩增稳定等优点，但是其开发成本较高。目前，SSR标记技术已应用于牡丹的杂种鉴定、种或品种分类鉴定中。Homolka等[9]从牡丹中开发了8对 SSR多态性引物，可用于鉴定芍药属牡丹组(Paeonia sect．Moutan)的17个品种和23个杂交后代，也可区分开牡丹组的杨山牡丹(P．ostii)、矮牡丹 (P．jishanensis)、滇牡丹(P．delavayi)、大花黄牡丹(P．ludlowii)和芍药组(Paeonia sect．Paeonia)的2个种。Yuan等[10]利用SSR标记鉴定出延安牡丹是一个杂交种，是以延安万花山当地的稷山牡丹为母系亲本，以其临近区域分布的紫斑牡丹为父系亲本经杂交起源的。
1.3.3 ISSR标记
ISSR(Inter－Simple Sequence Repeat)是 1994年Zietkiewicz等[11]在SSR技术的基础上创建的，是基于PCR扩增的一种分子标记技术，其基本原理是:根据真核生物基因组中广泛存在的 SSR设计单一引物，在SSR的 5'或 3'末端加锚1～4个碱基，对基因组的 DNA序列进行 PCR扩增。ISSR标记具有操作简单、成本低、多态性丰富等优点，但其仅具有显性的特点，不能鉴定纯合子和杂合子，因此不适宜用于父系分析和计算杂合度。ISSR标记技术在牡丹的遗传多样性检测、杂种鉴定、构建核心种质、种或品种分类鉴定等方面得到了应用。索志立通过试验证实ISSR分子标记技术是研究芍药属品种分类鉴定难得的有效工具，其将牡丹组肉质花盘亚组(subsect．Delavayanae)的大花黄牡丹和滇牡丹与革质花盘亚组(subsect．Vaginatae)的牡丹野生种和品种区分为2大类，与形态分类结果一致。刘萍利用 AFLP技术对牡丹品种的遗传多样性进行了研究，用3对引物组合进行选择性扩增，将30个牡丹种划分为5个聚类组。王佳等[12]建立了牡丹ISSR-PCR反应体系，为牡丹品种鉴定和遗传关系分析奠定了重要的技术基础。索志立等[13]利用ISSR标记进行了杨山牡丹和牡丹种间、紫斑牡丹和牡丹种间杂交后代的DNA分子证据研究，结果表明杂交后代同时含父母本的特征带，证实了花瓣基部带紫斑的栽培牡丹品种杂交起源的可能性。吴蕊等[14]对栽培牡丹与紫牡丹杂交后代进行了ISSR鉴定，结果表明杂交后代性状不一致，可将杂交后代幼苗分为偏母型、偏父型和中间型。
1.3.4 AFLP标记
AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术结合了RFLP和PCR的特点，是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切，之后将产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过 5'端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量片段从而形成指纹图谱[15]。AFLP具有多态性丰富、检测位点多、灵敏度高、结果稳定可靠等优点，但是其成本较高，操作步骤较复杂，且使用不合适的内切酶可能会导致假多态性。AFLP标记技术在牡丹的遗传多样性检测、亲缘关系分析、指纹图谱构建、种或品种分类鉴定、核心种质构建等方面得到了广泛应用。然而，其材料缺少野生类型的银屏牡丹 (P.suffruticosa subsp．yinpingmudan)。侯小改等利用AFLP标记技术发现革质花盘亚组与栽培牡丹亲缘关系从近到远的4个种依次为:杨山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵叶牡丹，且矮牡丹和卵叶牡丹有较近的亲缘关系，但研究材料中缺乏四川牡丹。同时，他们利用AFLP标记将30个牡丹品种完全区分开，发现多数选育地相同的牡丹种质亲缘关系较近;当其他性状相差不大时，株高相近的品种间亲缘关系相对较近[16]。