牡丹ISSR反应体系的优化研究+正交试验设计(6)
太阳牡丹（如图2-2），植株中等，株形直立。茎黄绿色，中型长叶，顶小叶突尖，黄绿泛红，叶脉明显，叶背光滑，幼叶颜色黄绿，叶柄长37㎝，斜展，青绿色，凹处红色，花蕾圆尖型，花朵侧开，荷花型，火红色，房衣紫色，柱头红色，花丝紫红色，花瓣基部有红晕，浓香型，花径21×9㎝，中开品种。结实力强，分枝力中，一年生枝长41㎝，吐芽少，生长势中。太阳，是日本品种。
图2-1 牡丹品种—凤丹 图2-2牡丹品种—太阳
Fig. 2-1 Paeonia suffruticosa Andr. Variety--P.ostii Fig. 2-2 Paeonia suffruticosa Andr. variety -- Tai Yang
实验用的Lambda DNA、Taq DNA聚合酶、dNIPs以及100bp DNA marker(100-1000、1200、1500、2000、3000bp)购自TaKaRa公司。ISSR引物由上海生工生物技术有限公司合成。
实验中使用的主要仪器有Eppendorf 5810 R型高速冷冻离心机、DYY-6C型电泳仪（如图2-4）、PTC-100TM型PCR仪（如图2-3）、JS-380型凝胶成像分析仪（如图2-4）。
图2-3 PTC-100TM型PCR仪
Fig. 2-3 PTC-100TM PCR instrument
图2-2 JS-380型凝胶成像分析仪和DYY-6C型电泳仪
Fig. 2-2 JS-380 gel imaging analyzer and DYY-6C type electrophoresis apparatus
实验中还涉及到化学药品的配制，例如EDTA、Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)等。
实验中EDTA(0.5mol/L，PH8.0)的配制：
将186.1g二水乙胺四乙酸二钠（EDTA-Na•2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节溶液的PH值至8.0（约需20gNaOH颗粒定容至1L）。分装后高压蒸汽灭菌。EDTA-二钠盐需加入NaOH将溶液的PH值调至接近8.0时，才会溶解。
TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
表2-1 实验中缓冲液的配制
Table 2-1 Preparation of buffer solution in the experiment
缓冲液 工作液（稀释液） 储存液（母液)
Tris-乙酸 1× 50×
（TAE) 40mmol/L Tris-乙酸 242g Tris碱、57.1ml冰乙酸<!>
1mmol/L EDTA 100ml0.5mol/L EDTA（PH 8.0）
2.2 牡丹基因组DNA的提取与检测
参照王佳等[12]方法，牡丹基因组总DNA提取(大量)采用CTAB微量法(4%CATB;100mmol/LTris-HCL(pH8.0);50mol/LEDTA;1.5mol/LNaCl;2%PVP;4%β-硫基乙醇）。所提模板DNA 的质量采用琼脂糖凝胶电泳法检测。
DNA的提取方法：①称取嫩叶片2g左右；②加液氮研磨(迅速)；③迅速转入15mlEP管中（约3ml左右）,加入5ml 4×CTAB（共加5次）（65℃致热30min，其中含200μl β-硫基乙醇）；65℃保温30-60min。期间不断颠倒摇匀；④冷却至室温，加入2.5ml的氯仿；异戊醇（24：1）+2.5ml饱和酚轻轻摇匀（5min左右），于4℃1000r/min离心10min（反复3次）；⑤移上清液至新管（动作轻缓），加10ml的遇冷无水乙醇，加1000μl醋酸钠溶液（3mol/L），轻轻颠倒摇匀，-20℃保存40-60min；⑥4℃1000r/min离心8min，去上清液，加70%乙醇洗沉淀2次，风干（第一次：8ml；第二次：5ml），第二次：4℃1000r/min 5min；⑦加500μlTE、5μlRNase，65℃水浴30min-1h；⑧冷却至室温，-20℃保存备用。